[发明专利]基于宏基因技术从霉变的甘蔗叶中筛选β-葡萄糖苷酶基因的方法

权利要求书

1.一种β-葡萄糖苷酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.一种重组β-葡萄糖苷酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

3.一种重组β-葡萄糖苷酶的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、霉变甘蔗叶微生物宏基因组DNA的提取：收集霉变的甘蔗叶10g，并将其剪至1-3cm长度，放入250ml三角瓶中；加入富集培养液，30℃震荡培养72h；离心收集菌体，菌体重悬于1.35mlDNA抽提buffer，混匀后加入0.15ml20％SDS，65℃水浴2h，期间每隔20min上下颠倒10次并液氮冷冻2min；6000g离心10min，收集上清，加入等v的氯仿，上下颠倒混匀；6000g离心10min，收集上清，加入0.6v的异丙醇，室温沉淀2h；16000g离心20min，弃上清，沉淀用75％的乙醇洗涤两次后，用ddH₂O溶解，即得粗提液；

2)、构建宏基因组文库：用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的大小，用核酸电泳检测仪检测DNA的浓度及纯度，对DNA进行纯化，并用限制性内切酶BamHI部分酶切总DNA，回收3-10kb的酶切片段；构建宏基因组文库；

3)、从宏基因组文库中筛选出β-葡萄糖苷酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；

4)、对获得的β-葡萄糖苷酶基因进行克隆、表达，得到β-葡萄糖苷酶重组蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

4.根据权利要求3所述的重组β-葡萄糖苷酶的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)中富集培养液包括以下组分：羧甲基纤维素钠5g/L；NaNO₃2g/L；K₂PO₃1g/L；KCl0.5g/L；MgSO₄0.5g/L；FeSO₄0.01g/L，余量为水，以上总量为100ml。

5.根据权利要求3所述的重组β-葡萄糖苷酶的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)中DNA抽提buffer包括以下组分：100mMTris-HCl，100mMEDTA-Na₂，100mM磷酸缓冲液，1.5MNaCl，1％CTAB，以上组分总量为1.35ml，其中，Tris-HCl的pH为8.0，EDTA-Na₂的pH为8.0，磷酸缓冲液的pH为8.0。

6.根据权利要求3所述的重组β-葡萄糖苷酶的筛选方法，其特征在于，所述步骤2)中构建宏基因组文库具体为：将回收得到的酶切片段和pUC118/BamHI(BAP)载体连接过夜，连接产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化后与电转化感受态细胞混合，冰上放置5min，转移DNA/细胞混合物至预冷的2mm电穿孔容器中，在电压为2，500V的条件下对电穿孔容器进行脉冲，立即添加900μl的LB至电穿孔容器中，37℃，180r/min，震荡培养30min，转化产物涂布到含有100μg/ml氨苄青霉素，0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷和100μΜ5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的平板上，平板倒置放入37℃培养箱中，培养15-18h；由此构建一个库容量达100000个转化子、多样性好的宏基因组文库。