[发明专利]一种同步检测三种柑橘病毒的RT-qPCR试剂盒

说明书

本发明公开了一种同步检测CYVCV、CTV和CTLV的实时荧光定量RT‑qRT试剂盒，包括如下3对病毒特异性RT‑qPCR引物：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6。本发明通过一步RT‑qPCR反应可以实现CYVCV、CTV、CTLV的同步检测及病毒定量。本发明方法与常规RT‑PCR检测方法相比，提升了CYVCV、CTLV和CTV检测灵敏度100倍以上，检测时间节省3倍以上，污染几率降低30％以上，在诊断病害发生和监控病害流行及维护柑橘产业安全等方面具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于植物病毒诊断技术领域，尤其涉及一种同步检测CYVCV、CTV和CTLV的三种柑橘病毒的RT-qPCR试剂盒。

背景技术

柑橘是世界第一大水果和全球第五大贸易农产品。2013年，我国柑橘栽培面积3633万亩，产量3321万吨，均居世界第一位。近年来，随着柑橘产业的快速发展，柑橘发生多病原混合感染及继发感染的情况越来越普遍。柑橘黄脉病毒、柑橘衰退病毒及柑橘碎叶病毒这三种病毒在生产上流行范围广、为害较大，且存在混合侵染的情况，对我国柑橘产业安全构成威胁。柑橘黄化脉明病毒引起的柑橘黄脉病是新近发生的一种病害。柠檬和酸橙感染CYVCV后，树势减弱、产量降低，严重影响其经济价值。自2009年在我国云南瑞丽首次发现以来，柑橘黄脉病在四川安岳、重庆等地也有发生，对部分地区的柠檬产业产生了比较严重的影响。CYVCV是α线性病毒科(Alphaflexiviridae)印度柑橘病毒属(Mandarivirus)病毒，除可接传播，还可能通过粉虱和蚜虫传播，因而具有大面积传播流行风险，对柑橘产业尤其是柠檬产业构成严重威胁。柑橘衰退病毒引起的柑橘衰退病是世界范围内一种极具经济重要性的病害，对世界柑橘产业造成过严重为害，目前依然威胁着以酸橙为砧的柑橘和对CTV茎陷点型株系敏感的葡萄柚、柚和甜橙的生产。虽然我国生产中多用抗病或耐病砧木，但广泛分布着CTV的各种强毒株和强力传媒褐色桔蚜，随甜橙等的大发展，CTV茎陷点型强株系的为害日趋严重。柑橘碎叶病毒引起的柑橘碎叶病是威胁柑橘生产的重要病害之一。现已报道发生柑橘碎叶病的国家有日本、美国、南非、澳大利亚和中国，其中以中国和日本发生最为普遍。CTLV在我国的浙江、湖南、福建和广西等地的局部地区已造成比较严重的为害。目前，用于上述单一病毒检测的方法较多，例如指示植物检测鉴定、电镜观察、酶联免疫(ELISA)、直接组织点免疫(DTBIA)，分子探针杂交等技术，并在生产中得到推广应用。随着分子生物学的发展，RT-PCR检测方法以其速度快、灵敏度高、特异性好等特点受到青睐。巢式RT-PCR，免疫捕获RT-PCR等则进一步提高了检测灵敏度或便捷性。

但是，生物学检测方法如指示植物鉴定耗时长且受环境等诸多条件限制，费时费力；血清学方法尤其DTBIA，操作简便，成本低廉，适合田间样品大规模检测，但其灵敏度及准确性有待提高；分子生物学方法如RT-qPCR检测法快速、灵敏、特异，是目前采用的主要检测方法之一，但也存在需要多次分病毒繁琐操作，时间成本高，污染几率较大，并且需要接触有毒物质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同步检测三种柑橘病毒的RT-qPCR试剂盒，旨在解决生物学检测方法受环境条件限制，费时费力；血清学方法灵敏度及准确性较低；分子生物学方法存在需要多次分病毒繁琐操作，时间成本高，污染几率较大，需要接触有毒物质的问题；并进一步提高检测灵敏度。

本发明是这样实现的，一种同步检测三种柑橘病毒的RT-qPCR试剂盒，所述同步检测三种柑橘病毒的RT-qPCR试剂盒对CYVCV、CTV、CTLV三种病毒的特异引物同管混合包装，CYVCV、CTV、CTLV三种病毒上下游引物浓度分别为：CYVCV1.3μM、CTV1.0μM、CTLV2.7μM；CYVCV、CTV、CTLV三种病毒扩增产物特征Tm值范围：CYVCV为86.25±0.35℃、CTLV为84.00±0.25℃、CTV为81.25±0.25℃；

CYVCV、CTV、CTLV三种病毒特异性RT-qPCR引物序列如下：