[发明专利]云杉矮槲寄生害的LAMP检测方法

说明书

本发明涉及云杉矮槲寄生害(Arceuthobium sichuanense)的分子检测，属于生物技术领域。本发明基于云杉矮槲寄生与其寄主云杉的clpP基因序列差异，通过比对云杉矮槲寄生与其寄主云杉的序列差异性，设计了一组特异性引物(4条)。同时本发明提供了一组检测云杉矮槲寄生害的LAMP引物组序列，还进一步提供了检测云杉矮槲寄生害的检测方法。本发明的引物特异性好，检测方法快速简便，准确性高，为云杉矮槲寄生害的早期诊断及病害防控提供了有效的技术保障。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一组LAMP引物，能够快速检测出寄主体内是否有潜伏侵染的云杉矮槲寄生。

背景技术

天然云杉林在我国西部生态脆弱地区具有无可替代的生态价值，发挥着保持水土和涵养水源等重要生态功能，是我国西部乃至全国生态环境安全的重要保护屏障。云杉矮槲寄生害是目前我国云杉林毁灭性灾害之一，造成三江源地区云杉天然林和次生林的严重病害，在经济和生态环境上带来巨大的损失。仅2003年，在青海省门源县仙米林场就因云杉矮槲寄生害被迫砍伐1.1万立方米的云杉。到2007年，整个青海省的发生面积已达到1.3万公顷。预防与控制云杉矮槲寄生害已成为我国西部乃至全国生态环境安全的重要议题。

云杉矮槲寄生(Arceuthobium sichuanense)是檀香目、桑寄生科、油杉寄生属的多年生寄生性种子植物，主要分布于我国青海、四川、西藏和甘肃等省(自治区)。云杉矮槲寄生通过种子进行传播，种子萌发产生胚根进行侵染。胚根侵入寄主枝条后，寄生于云杉属树木的枝干上，依靠其内寄生系统与寄主建立寄生关系，建立位于寄主组织内部的内寄生系统。云杉矮槲寄生的内寄生系统可以在寄主体内扩展，从而进行系统侵染，并吸取寄主营养和水分，造成寄主生长畸形，形成丛枝、膨大等症状。侵染严重时，可以直接导致寄主死亡。然而，由于云杉矮槲寄生从侵入寄主到显现症状需要5～8年的潜伏期，因此造成在病害防治过程中不能及时发现病害，延误了云杉矮槲寄生害的有效防治。

随着PCR等分子生物学技术的发展和推广，越来越多的分子检测技术运用到植物病害诊断的过程中。利用PCR检测方法对云杉矮槲寄生的检测已有研究，例如申请号为201410153628.5的发明专利申请公开了一种云杉矮槲寄生的PCR检测引物及其应用和PCR检测方法，该发明涉及一对基于ITS2片段的云杉矮槲寄生PCR快速检测引物，所述引物包括如下基因序列：dwF3：5‘-ACAAACTCATTTTCCCACCACA-3’；dwR3：5‘-ACATTCAAGAAACCTGACACCC-3’。虽然该发明的引物具有检测周期短、操作简单、结果可靠及灵敏度高等优点，可以有效地监测和早期预警云杉矮槲寄生的侵染动态，指导制定科学的病害管理策略，对及时采取有效措施防治云杉矮槲寄生害具有重要意义，但是，基于PCR的检测技术都需要PCR仪等昂贵设备，难以用于基层和现场检测。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15-60分钟内实现10⁹-10¹⁰倍的扩增，反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。

LAMP能在等温(60-65℃)条件下，短时间(通常是一小时内)内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。环介导等温扩增法是一种全新的核酸扩增方法，具有操作简单、快速、特异性强、产物易检测等特点。LAMP技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不需要PCR仪和昂贵的试剂，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，仅通过肉眼观察即可判断检测结果，检测成本远低于荧光定量PCR，在病原物检测及病害诊断领域具有广泛的应用前景。

发明内容