[发明专利]AIV H7N9亚型双重微滴式数字PCR绝对定量检测试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测禽流感病毒H7N9亚型的特异性引物和探针组合，其特征在于，包括以下2对特异性引物对和2条分别与引物对配合使用的特异探针，其核苷酸序列分别为：

HA-F：CCAGTGCATGTAGGAGATCAG

HA-R：ACTTAGTCATCTGCGGGAAAG

HA-P：HEX-CAGCATTGTCTGTGTTTGACAGGAGC-BHQ3

NA-F：GGGAAACACTCAAACGGAAC

NA-R：TCATGGCAACTAGTACTTGACC

NA-P：FAM-CCAGCTTATCAGGGCGCGATACT-BHQ1。

2.权利要求1所述的特异性引物和探针组合在制备禽流感病毒H7N9亚型检测试剂盒或检测试剂中的应用。

3.一种含有权利要求1所述特异性引物和探针组合的试剂盒。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其为双重微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包含病毒总RNA提取试剂和检测试剂；所述检测试剂包括无RNA酶的蒸馏水，一步法ddPCR探针法预混液，探针法ddPCR微滴发生油，质控液，阴性对照和阳性对照。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有AIV-H7N9HA基因组的RNA和NA基因组RNA的混合液，阴性对照为无RNA酶蒸馏水。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述一步法ddPCR探针法预混液其900μl的配方为：500μl的2XOne-stepRT-ddPCRSupermix，HA上、下游引物分别为90μl，NA上、下游引物分别为90μl，HA和NA的特异探针分别为20μl，引物和探针的浓度均为10μM。

8.如权利要求4-7任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的工作程序为：

(1)配制ddPCR反应液；ddPCR反应液20μl配方为：一步法ddPCR探针法预混液18μl，待测样品RNA模板为2μl。

(2)制备微滴，然后将微滴转入PCR板，于PCR仪中进行扩增；

(3)将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴，分析数据，显示检测结果。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，步骤(2)中PCR的扩增程序为为50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec，54～56℃退火60sec，共40个循环；98℃10min结束反应，每步都设置2.5℃/sec的升降温速度。

10.权利要求3-9任一所述的试剂盒在食品卫生检验检疫中的应用。