[发明专利]唐菖蒲伯克霍尔德菌的实时荧光PCR检测试剂盒和方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种利用核酸扩增技术进行唐菖蒲伯克霍尔德菌快速检测的试剂盒和方法。

背景技术：

唐菖蒲伯克霍尔徳氏菌（Burkholderiagladioli）为植物致病菌、人的条件致病菌（可导致人产生肺炎症状），也是食品中关键中毒、致病菌。印尼的椰毒发酵食物，中国东北等地的酵米面，养殖的鲜银耳因污染此菌导致食物中毒，已引广泛重视。其所引起的食物中毒致死率极高，在我国东北和西南的发酵米面食物中毒事件中，死亡率达到40%以上。唐菖蒲伯克霍尔德菌首先于1921年作为一种能够侵染唐菖蒲和其他花类植物的植物病原细菌而被提及。该种病菌可能导致囊纤维化和免疫力低下的部分病人发生肺炎症状。但最近，Khan和他的同事们报道由唐菖蒲伯克霍尔德菌引起的脓血症和菌血症。然而，感染通常发生于肺移植时，期间通过胸腔侵染。还有一些报道相继描述了唐菖蒲伯克霍尔德菌肺炎和严重的脓毒症。唐菖蒲伯克霍尔德菌最早的名称是Pseudomonasgladioli，Severini在1913年首次描述了这种病原菌。后来P.gladioli与其他6个同属于假单胞菌属rRNAGroup11的菌种一起被划分到了一个新属伯克霍尔德菌属(Burkholderia)，从而被命名为Burkholderiagladioli。目前，唐菖蒲伯克霍尔德菌共包括4个致病型，分别是B．gladiolipv．gladioli、B．gladiolipv．alliicola、B．gladiolipv．agaricicola和B．gladiolipv．cocovenerans。当前，基于DNA的病原细菌检测方法中，实时荧光PCR法以其操作简便、灵敏、特异、快速、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点，得到研究者的普遍认可，成为检测的重要工具。这对于加强环境中的的监控，提高检测效率和确证的准确度，对有效控制唐菖蒲伯克霍尔德菌的传播,在现阶段具有重要的实际意义。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是针对唐菖蒲伯克霍尔德菌ITS基因序列，设计一组特异性引物和探针，进而制作一种检测试剂盒，同时建立一种快速检测唐菖蒲伯克霍尔德菌DNA的方法，以克服现有的检测方法在某些食品和植物检测中的局限性，为唐菖蒲伯克霍尔德菌检测提供有效工具，从而确保食品和植物安全性，保护消费者利益。

本发明的主要原理为：针对保守序列设计一组引物和探针。进行核酸检测时，模板DNA经加热至94-95℃一定时间后，DNA双链解离，引物及Taqman探针与模板特异性结合。探针的5端标记有报告荧光集团，3端有淬灭荧光集团。当探针完整的时候，报告集团所发射的荧光能量被淬灭集团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中，遇到与模板结合的探针时，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告集团远离淬灭集团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。随着PCR循环的增加，目的片段成指数增长，荧光信号也同步增强，荧光信号的强弱直接反映模板数量。

本发明涉及的唐菖蒲伯克霍尔德菌实时荧光PCR检测用的引物和探针，其序列如下：

(1)上游引物：5′-GTCTTGATAAGGCGGGGGTC-3′；

(2)下游引物：5′-GCTTGACCCGAACGTTTGTC-3′；

(3)TaqMan探针：5′-TTGCAAGCAGGGGGTCGTCG-3′，其5′端标记FAM报告荧光集团，3′端标记TAMRA淬灭荧光集团；

在应用中，上游引物、下游引物、TaqMan探针的体积比为：1∶1∶1。

本发明提供的唐菖蒲伯克霍尔德菌的检测试剂盒，包括如下试剂：

(1)2×PCRMasterMix

包括0.05u/μLTaqDNA聚合酶，反应缓冲液，4mmol/L氯化镁，0.4mmol/LdNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)；

其中反应缓冲液含有20mmol/LpH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾和2％曲拉通X-100；

(2)上游引物：10μmol/L，序列为：5′-GTCTTGATAAGGCGGGGGTC-3′；