[发明专利]亚利桑那菌LAMP法检测用的引物和检测方法

权利要求书

1.亚利桑那菌LAMP法检测用的引物，由4个单独引物组成，这4个单独引物是引物F3、引 物B3、引物FIP和引物BIP，这4个单独引物的序列如下：

引物F3：AGCAGTTCCGCCGTCG；

引物B3：TACGGCAGCAGGGTCG；

引物FIP：CGGTATTTGCTGGTTAATGGAGGGACAGGCAGAGCG；

引物BIP：GCTGGTTAATGACATTCTGGAGCGTTTCATCCACCGACT。

2.用权利要求1的亚利桑那菌LAMP法检测用的引物对亚利桑那菌进行LAMP法检测的方 法，包括以下步骤：

步骤1、制备含亚利桑那菌标准菌种DNA：225ml缓冲蛋白胨水(BPW，BufferedPeptone Water)中添加亚利桑那菌标准菌种，培养18-24小时后，用灭菌生理盐水对缓冲蛋白胨水 BPW培养液进行梯度稀释，使用GB4789.2-2010方法对进行细菌计数，制得含有亚利桑那菌 浓度为10⁶CFU/mL的稀释液，然后将该稀释液取1.0ml，提取稀释液中的亚利桑那菌标准菌 DNA；得到，含亚利桑那菌浓度为10⁶CFU/mL的亚利桑那菌标准菌DNA；

步骤2、选用LAMP法检测细菌的DNA扩增试剂盒

选用LAMP法检测细菌DNA的试剂盒为：Loompamp朗报荣研化学株式会社的DNA扩增试剂 盒，该DNA扩增试剂盒组成为：

（1）2×反应缓冲液（RM），

（2）BstDNA聚合酶（BstDNAPolymerase），

（3）去离子水（DW），

（4）引物溶液DNA（PMDNA），

（5）阳性对照DNA（PCDNA）；

步骤3、用本发明的引物进行LAMP法检测DNA

（3.1）、配制LAMP法检测液：在生物安全柜中冰上操作，向Loopamp朗报反应试管中加入 下述各原料：

加入12.5μL的2×反应缓冲液（RM），

加入6.5μL去离子水（DW），

加入0.5μL的引物F3，

加入0.5μL的引物B3，

加入0.5μL的引物FIP，

加入0.5μL的引物BIP，

加入1.0μL的BstDNA聚合酶；

得到装有LAMP法检测液各原料的反应试管；

所述的引物为：

引物F3：AGCAGTTCCGCCGTCG；

引物B3：TACGGCAGCAGGGTCG；

引物FIP：CGGTATTTGCTGGTTAATGGAGGGACAGGCAGAGCG；

引物BIP：GCTGGTTAATGACATTCTGGAGCGTTTCATCCACCGACT；

（3.2）、配制含有被检测物的反应试管：

向3.1步骤中的反应试管加入3.0μL步骤1获得的含亚利桑那菌浓度为10⁶CFU/mL的亚 利桑那菌标准菌DNA液体；

（3.3）、对反应试管进行反应处理

对反应试管进行轻击，使溶液充分混合后，用离心机在每分钟14000rpm的条件进行瞬 时离心处理，混合时注意不要产生气泡；然后放入63℃恒温水浴锅中水浴60min进行反应， 再放入95℃恒温水浴锅中水浴2min，使反应体系中的BstDNA聚合酶灭活每个反应试管中 的反应物，以终止反应；

（3.4）、观察反应结果：反应试管有白色浑浊为阳性。