[发明专利]山羊RanBP9基因克隆及在精子中的定位检测方法

说明书

技术领域

本发明公开了山羊Ran结合蛋白9（RanBP9）基因克隆及其在精子中的定位检测方法，涉及生物技术领域。

背景技术

RanBP9在胚胎干细胞中可以自行发育，且在精子和卵子发生过程中具有重要调节作用，也是一种由多个部分组成的脚手架蛋白质，在介导细胞表面受体蛋白和细胞内信号传递中发挥着重要功能。RanBP9蛋白功能的发挥与多种生物过程相关，例如，细胞增殖和凋亡、性腺的生长和发育等。另外，RanBP9是小鼠精子发生和卵子发生过程中必不可少，且在精细胞繁殖阶段的睾丸突变体发育中，RanBP9有一个显著的下降过程。同时也是一种神经性受体的新颖结合蛋白，在胞浆内作为交互器诱导信号传导，在胚胎干细胞中可以自行发育，且在精子和卵子发生过程中具有重要调节作用。

但山羊RanBP9基因序列及其在精子中的定位检测还是空白。我们利用酵母双杂交技术筛选出了RanBP9基因，本发明的目的是克隆山羊RanBP9序列，其在精子中的定位检测，为研究其在山羊生长发育中的功能奠定基础。

发明内容

本发明是根据相关的生物技术，公开了山羊Ran结合蛋白9（RanBP9）基因克隆及其在精子中的定位检测方法，按以下步骤进行：

一、RT-PCR克隆山羊的RanBP9基因。

二、Q-PCR检测RanBP9mRNA在山羊睾丸、附睾组织中的相对表达量。

三、制备山羊睾丸、附睾组织切片；组织免疫荧光技术检测RanBP9蛋白在山羊睾丸、附睾组织中的表达。

四、精子细胞免疫荧光技术研究RanBP9蛋白在精子中的定位。

本发明克隆出山羊的RanBP9序列，得到RanBP9蛋白在山羊精子中的表达定位，最终为研究RanBP9在山羊精子转染外源DNA中的作用机制奠定基础。

附图说明

图1是山羊睾丸组织总RNA提取图，1-4均为样品。

图2是山羊RanBP9基因序列扩增图，1-4均为PCR产物，M为marker（DL2000）。

图3是RanBP9mRNA在睾丸、附睾头、附睾体、附睾尾和脾脏组织中相对表达量图，大写字母：P<0.01，小写字母：P<0.05。1：睾丸，2：附睾头，3：附睾体，4：附睾尾，5：脾脏。

图4是RanBP9蛋白在睾丸和附睾组织中的检测结果图，A:实验组，B：对照组（1%PBS代替一抗）。1：睾丸，2：附睾头，3：附睾体，4：附睾尾，200倍倒置显微镜下观察。

图5是RanBP9蛋白在山羊精子中的定位图，A1，A2分别表示RanBP9蛋白，400倍倒置显微镜下观察。

具体实施方式

本发明中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

具体实施方式一：本实施方式主要是克隆山羊的RanBP9基因序列，其特征在于按以下步骤进行：

一、山羊睾丸组织总RNA提取（按照动物组织总RNA提取试剂盒说明书进行）及RNA完整性和纯度检测（如图1）；

二、反转录获得cDNA模板，反应体系及程序按下表进行；

表1反转录体系