[发明专利]一种鸭黄病毒RT-LAMP检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测鸭黄病毒的RT-LAMP试剂盒。

背景技术

鸭黄病毒又名鸭坦布苏病毒（DuckTembusuvirus）属于黄病毒科（Flaviviridae），黄病毒属（flavivirus）。2010年江浙沪一带爆发了一种以蛋鸭产蛋率下降、生长迟缓、减重、食欲减退、高热及部分死亡为症状的疾病，从病鸭体内分离到了致病病毒，经过基因序列比对，该病毒被认为是属于一个新的基因型，为TMUV组的黄病毒属的病毒。

目前，鸭黄病毒检测主要依赖病毒分离和分子生物学检测。病毒分离是鸭黄病毒的传统检测方法；分子生物学检测方法有RT-PCR、套式RT-PCR、荧光定量RT-PCR等，这些方法操作繁琐、耗时较长。环介导等温扩增技术是日本学者Notomi于2000年发明的一种基因恒温扩增新技术，其特点是针对靶基因的6个区域设计3对特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)保温30-60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，该方法不需要电泳及紫外观察等过程，且灵敏度、特异性都优于PCR技术，而且不需要任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，检测成本低。本发明拟利用LAMP技术，建立一种灵敏特异，快速简便的检测鸭黄病毒的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、结果准确的检测鸭黄病毒的RT-LAMP的试剂盒，以克服现有技术的不足。

本发明为实现上述目的，采用环介导恒温扩增技术，该技术是在核酸水平上的一种检测技术，具有准确性好、灵敏度高、操作简单等特点。

本发明提供的试剂盒包括以下组分：

1）RT-LAMP反应液：内含浓度为8mmol/LMgSO₄，5.6mmol/LdNTPMixture；

2）引物混合液；检测鸭黄病毒的引物组按照F3:B3:FIP:BIP:LF:LB为5nM:5nM:40nM:40nM:20nM:20nM的比例混合；

其中所涉及的检测引物序列为：

上游内引物FIP序列：

5’-GCGGCATGTTTCAGCGACTGCATGGTTCCACGGAAGCG-3’,

下游内引物BIP序列：

5’-AACGCCCAAAAGTCCCGTCTACGGGGTTCACATTCGAGTGTG-3’.

上游外引物F3序列:

5’-GCAGAAGGAAAACGTCCAGT-3’

下游外引物B3序列：

5’-CCCATGTCAACCCCAGATC-3’,

上游环引物LF序列

5’-GGCTGAATAATTGTGGTAGGTGCT-3’,

下游环引物LB序列

5’-ACCGCTGAGATGGAGGATTATG-3’

3）酶混合物：浓度均为5U/μL的AMV反转录酶与8000U/mL的BstDNA聚合酶按1：1比例混匀分装；

4）目视荧光染料。

5）DEPC水：内含浓度为1‰的焦炭酸二乙酯。

6）阴性对照：ddH2O。

7）阳性对照：利用鸭黄病毒E基因构建的假病毒颗粒。

本发明提供的检测方法具体步骤是：

采集禽类样品后，将样品和本试剂盒中的阳性对照用常规试剂盒提取核酸RNA，从上述试剂盒中取出RT-LAMP反应液、酶混合物，引物混合液，DEPC水在室温下融化后，2000r/min离心5s；每管测试反应体系加入：RT-LAMP反应液，7.5μL；引物混合液，6μL；酶混合物，2μL；目视荧光染料，1μL；DEPC水，3.5μL；再分别加入处理后制备的阳性对照和样品的RNA溶液及阴性对照各5μL，盖紧管盖，于4000r/min离心5s；将PCR管排好，放入63℃水浴锅水浴1小时或是放入PCR仪运行63℃保温1小时。

反应结束后进行结果检测，具体包括三种：

（一）RT-LAMP反应的目视检测方法：

阴性对照呈现浅橘黄色，阳性对照呈荧光绿色，样品根据反应后管内液体的颜色进行判断阴性阳性。

（二）RT-LAMP反应的浊度检测方法

反应结束后，将所有PCR管进行离心10000rpm，1min，观察管底，阴性对照管底无沉淀，阳性对照有白色沉淀，样品根据有无白色沉淀进行判断阴阳性。

（三）RT-LAMP反应的凝胶电泳检测方法