[发明专利]循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒。

背景技术

循环肿瘤细胞(CTC，CirculatingTumorCell)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，大部分CTC在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。

近年来研究表明，肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中可能发生上皮-间质转变(ETM，Epithelial-mesenchymal Transition)，发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的肿瘤细胞迁移和侵袭能力增强。有研究者应用免疫荧光染色检测转移性NSCLC患者CTCs间质标志物vimentin及上皮标志物Keratin mRNA的表达情况，结果在来自于检测的几乎所有CTCs中都可以观察到共同强表达这2个指标，没有发现只表达keratinmRNA的CTCs，但在3例患者中检测到很少几个只表达vimentin mRNA的CTCs。此研究首次证实了具有上皮/间质混合性表型CTCs的存在。而NSCLC原发性肿瘤的表型则是keratin mRNA阳性、vimentin mRNA阴性。此外，其他研究者应用AdnaTest方法检测乳腺癌患者CTCs中3种EMT标志物mRNA(TWIST1、Akt2、PI3Kα)，结果29％患者至少一种阳性。有学者分析乳腺癌患者CTCs单细胞转录谱后发现，尽管CTCs之间存在基因表达差异，但是普遍高表达EMT相关分子TGF-β1、vimentin和CXCR4。另外一些实验也证实肿瘤患者CTCs高频出现共表达上皮标志物(EpCAM、cytokeratins、E-cadherin)、间质标志物(vimentin、N-cadherin、O-cadherin)和干细胞标志物(CD133)的现象。在另一项研究中，研究者检测了乳腺癌CTCs中EMT相关转录因子mRNA(TWIST1、SNAIL1、SLUG、ZEB1、FOXC2)的表达情况，并分析了接受或未接受新辅助化疗对CTCs表达这些转录因子的可能影响，发现新辅助化疗并不能清除这些发生了EMT的CTCs。推测EMT很可能通过赋予CTCs干细胞特性使CTCs耐受化疗。因此，检测CTCs亚型对于指导分子靶向药物的研发及临床个体化治疗具有重要意义。

目前，多数CTCs检测方法都是以肿瘤细胞表面的上皮细胞标志物为靶点，如上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EPCAM)，用相应的抗体捕获CTCs，以细胞表达CKs作为主要诊断依据，这类方法涉及的EPCAM和CKs都具有上皮细胞特异性。其中，代表性检测方法是目前唯一通过美国FDA批准进行临床应用的CellSearch系统。由于外周血 中可能存在一定数量的非肿瘤性上皮细胞，以及采血可能造成正常上皮细胞污染血样，加上一些CTCs由于发生EMT丢失了上皮抗原而无法被检测到，从而导致假阳性和假阴性的检测结果，此外，免疫磁性分选(MACS)技术联合逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法也是常用的CTC分离与鉴定的技术，但是RT-PCR过程对环境和操作的要求高，且mRNA容易降解，无法进行CTC细胞分型等缺点，因此，急需一种能够准确检测CTCs的技术，实现CTCs的的鉴定与精确分型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高的循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒。

实现上述目的的技术方案如下。

一种循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒，包括针对每种标志基因mRNA的捕获探针、扩增探针和标记探针，所述标志基因mRNA包括有如下两类：选自EPCAM、E-cadherin、CEA、KRT5、KRT7、KRT17、KRT20中的至少两种的上皮细胞标志基因mRNA，选自VIMENTIN、N-cadherin、TWIST1、AKT2、ZEB2、ZEB1、FOXC1、FOXC2、SNAI1、SNAI2中的至少两种的间质细胞标志基因；其中，