[发明专利]一种检测抗生物素蛋白的比率型荧光探针及其合成方法和应用

说明书

本发明涉及一种检测抗生物素蛋白的比率型荧光探针及其合成方法和应用。该探针通过中间体4‑(2‑(N,N‑二乙基氨基)乙酰基)氨基‑1,8‑萘酐与生物素等反应得到，其合成方法操作简单、原料低廉。该探针在水与甲醇不同比例下出现～470nm与～550nm两个荧光峰。在20mM的磷酸缓冲液中其呈现出～470nm荧光主峰，当向其中加入0‑2.0当量抗生物素蛋白后，～470nm的荧光峰逐渐降低而～550nm处荧光峰逐渐增强，从而达到对抗生物素蛋白的比率检测。

技术领域

本发明涉及一种用于比率检测抗生物素蛋白的荧光探针的合成及应用。

背景技术

蛋白质是生命科学研究的主要内容之一，其是细胞和生物功能的重要体现者。各种蛋白的表达都与人的正常生理生命活动息息相关。因而，对于蛋白的检测、功能的研究、实时的追踪显得极其重要。现在对蛋白质的检测主要有凯氏定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、考马斯亮蓝法、酚试剂法等，这些方法较为繁琐、费时、需大量前期准备。因此，荧光检测技术因为其高灵敏度、操作简便、快速响应等优势逐渐被成功应用于蛋白的检测与功能研究中。

近年来，基于小分子荧光探针的蛋白检测方法逐渐受到生物研究工作者的重视，其能够在蛋白结构与功能研究以及检测中起到至关重要作用。小分子荧光探针与蛋白结合后的荧光变化能够将蛋白微观的变化以荧光这种宏观形式展现给研究工作者，借助生物荧光成像等系统可以观测到实时动态的变化。然而，现在对于大多检测、标记蛋白的荧光探针来说，其局限于单一的荧光增强并伴有蓝移，其受到设备、样品等外界因素影响较大。而能够克服此类缺点的检测蛋白的比率型荧光探针较为少见。

生物素是动、植物体内广泛存在的一种小分子生长因子，又叫维生素H。其能与抗生物素蛋白(亲和素)特异性结合，且二者亲和力比抗原-抗体结合力高出百万倍。因此，生物素-亲和素系统因为其高亲和力、高稳定性、高灵敏度、高特异性等优点被广泛应用于分子生物学、免疫学等领域。

发明内容

本发明的目的之一是提供种用于比率检测抗生物素蛋白的荧光探针，该探针能够与抗生物素蛋白特异性结合并进行比率的识别。

本发明的另一目的是提供一类用于比率检测抗生物素蛋白的荧光探针的合成方法，该方法具有原料低廉、简单、易提纯等优点。

本发明提供一种用于检测抗生物素蛋白的比率型荧光探针，以1,8-萘酰亚胺为荧光基团，2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基为响应基团，生物素为靶向基团，该荧光探针能够与抗生物素蛋白特异性结合。当向探针测试液中加入抗生物素蛋白后，～470nm的荧光峰逐渐降低而～550nm处荧光峰逐渐增强，该荧光探针具有如下结构：

一种检测抗生物素蛋白的比率型荧光探针的合成路线，如下：

合成的具体步骤如下：

(1)中间体N-Boc-乙二胺的合成：

将二碳酸二叔丁酯溶于二氯甲烷中，并在冰浴下滴加乙二胺。室温下搅拌过夜(10-16h)，饱和食盐水洗涤，并加入无水硫酸钠干燥，过滤得澄清溶液，旋干得N-Boc-乙二胺无色油状物。

(2)中间体N-Boc-N-生物素乙二胺的合成：

将EDC.HCl,HOBt.H₂O,三乙胺，生物素溶于DMF中，并向其中加入N-Boc-乙二胺，室温搅拌18-20h，减压除去溶剂，硅胶柱分离得N-Boc-N-生物素乙二胺白色固体。

(3)探针的合成：

将N-Boc-N-生物素乙二胺溶于二氯甲烷中，加入三氟乙酸，室温下搅拌0.5-2h，减压除去溶剂，残留物溶于乙醇中，并加入4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐，加热至80-90℃，3-6h，旋干，硅胶柱分离得到淡黄色固体。