[发明专利]一种从脐带外层羊膜组织中分离提取hUC-MSC的方法

权利要求书

1.一种分离提取hUC-MSC的方法，其特征在于，所述方法包括：采用红细胞裂解液与胶原酶处理脐带外层羊膜组织。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述红细胞裂解液为包含NH₄Cl和Na₂-EDTA的水溶液，优选为包含1-20g/L的NH₄Cl和0.05-0.2mMNa₂-EDTA的水溶液，更优选为包含5-10g/L的NH₄Cl和0.1mMNa₂-EDTA的水溶液，pH为7.2-7.4；

优选地，所述胶原酶为IV型胶原酶，优选为包含IV型胶原酶的消化液，优选为包含IV型胶原酶、透明质酸酶、DNA酶和血清替代物的D-Hank’s液，更优选为包含1％IV型胶原酶、0.5％透明质酸酶、300U/mlDNA酶和2％血清替代物的D-Hank’s液。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将获得的脐带外层羊膜组织分割成组织块，加入1-3倍组织块体积的所述红细胞裂解液，室温下处理2-5分钟；然后向经处理的组织块中加入所述包含IV型胶原酶的消化液再次处理。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：经胶原酶消化后，采用间充质干细胞无血清培养基培养，以获得原代间充质干细胞；其中所述间充质干细胞无血清培养基包含a-MEM/DMEM-F12、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)和血清替代物；

优选地，所述间充质干细胞无血清培养基包含0.05-0.2体积份的β-巯基乙醇、0.5-2体积份的非必需氨基酸水溶液、8-12体积份的血清替代物、85-95体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为5-15ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子，其中所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸；

更优选地，所述间充质干细胞无血清培养基包含0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液、10体积份的血清替代物、89体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子；

最优选地，所述间充质干细胞无血清培养基由所述a-MEM/DMEM-F12、β-巯基乙醇、非必需氨基酸水溶液、重组人碱性成纤维生长因子和血清替代物组成。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将获得的脐带外层羊膜组织剪成1-3mm³大小的组织块，加入1.5-2倍组织块体积的红细胞裂解液，室温下处理2-5分钟；然后向经处理的组织块中加入2-3倍体积的所述包含IV型胶原酶的消化液，在37℃和5％浓度的CO₂下消化8-12小时；

优选地，所述方法还包括：以1-5×10⁴细胞/cm²培养皿面积的密度将得到的细胞接种于间充质干细胞无血清培养基中，在37℃和5％浓度的CO₂下培养，每3-4天更换新鲜培养基。