[发明专利]奶粉中三种脂溶性维生素A,E和K1的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及脂溶性维生素的检测方法，尤其涉及奶粉中三种脂溶性维生素A,E和K₁的检测方法。

背景技术

脂溶性维生素A,E,K₁通常作为营养强化剂添加到配方奶粉中。维生素A又称视黄醇，主要生理功能是维持视觉和骨骼健康、参与细胞分裂和细胞识别、参与生长、生殖及维持免疫系统的完整性等。维生素E又称生育酚，自然界中共有8种：α-，β-，γ-，δ-生育酚和α-，β-，γ-，δ-三烯生育酚，其中以α-生育酚的生物学活性最强。维生素K₁别名植物甲萘醌，控制血液凝结，是凝血蛋白在肝内合成必不可少的物质。这几种脂溶性维生素在外界环境中不稳定，很容易受光、氧等影响而被氧化破坏。目前配方奶粉中脂溶性维生素的测定方法通常是：样品经过酶解和皂化处理后，用非极性有机溶剂(常用的有石油醚、正己烷、乙醚等)液液萃取，然后用反相色谱法进行分离检测，前处理过程溶剂消耗量大、操作繁琐且测定结果不稳定。

配方奶粉中通常不直接添加维生素A和维生素E，而是添加维生素A酯和维生素E酯，因此需先将样品通过皂化处理后，将待测维生素游离出来后再进行检测，方法复杂繁琐。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便、快速、高灵敏的奶粉中脂溶性维生素A、E和K₁的检测方法。

为实现上述目的，本发明提供一种奶粉中脂溶性维生素A,E和K₁的检测方法，其特征在于，步骤为，

样品制备：称取样品于比色管中，加入温水溶解定容至刻度后，取部分定容后的样品溶液于离心管中，加入无水乙醇沉淀蛋白，再加入正己烷提取，加入饱和氯化钠溶液抑制乳化，混匀后高速离心分层，取最上面的正己烷层氮气吹干后，用甲醇溶解定容，经0.22μm滤膜过滤后即可；

样品检测：将待测样品和标准工作溶液在液相色谱-串联质谱仪检测，分别进样，获得以标准溶液中维生素A、维生素A醋酸酯、维生素A棕榈酸酯、维生素E、维生素E醋酸酯、维生素K₁这6种脂溶性维生素的浓度为横坐标，再以标准溶液中维生素A、维生素A醋酸酯、维生素A棕榈酸酯、维生素E、维生素E醋酸酯、维生素K₁这6种脂溶性维生素的峰面积为纵坐标的工作曲线；用工作曲线对定量离子进行定量计算获得待测样品溶液中6种脂溶性维生素的浓度；维生素A以维生素A、维生素A醋酸酯、维生素A棕榈酸酯换算成维生素A的总量计算，维生素E以维生素E、维生素E醋酸酯换算成维生素E的总量计算；具体换算方法如下：

C_维生素K1＝C_维生素K1；

其中C_维生素A表示维生素A的浓度，C_{维生素A醋酸酯}表示维生素A醋酸酯的浓度，以此类推；

即得到待测样品的维生素A、维生素E、维生素K₁的浓度。

进一步，所述样品制备为称取0.5～2.0g左右样品于5～20mL比色管中，加入40～60℃温水溶解定容至刻度，优选45℃温水；，分取1～2mL于20mL离心管中，加入2～10mL无水乙醇沉淀蛋白，然后加入1～5mL正己烷提取，并加入2～10mL饱和氯化钠溶液抑制乳化，混匀后5000rpm高速离心，取正己烷层氮气吹干后，用甲醇溶解定容至1mL或2mL，经0.22μm滤膜过滤后即可。

进一步，所述标准工作溶液为10.0μg/mL的维生素A、维生素A醋酸酯、维生素A棕榈酸酯、维生素E、维生素E醋酸酯和维生素K₁的乙醇溶剂的标准工作溶液。

进一步，所述液相色谱-串联质谱仪的检测为，选用水-乙腈为流动相，反相液相色谱柱分离，采用大气压化学电离串联质谱进行检测，正离子扫描模式，多反应监测MRM扫描检测，外标法定量；

色谱条件：Phenomenex Kinetex C₁₈色谱柱(100×4.6mm i.d.，粒径2.6μm)；柱温35℃；流速1.0mL/min；进样量5μL；流动相为水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序：0-4.0min，90％B；4.1-18.0min，100％B；18.1-22.0min，90％B；