[发明专利]一种快速检测番茄灰霉菌的荧光定量PCR检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种PCR快速检测番茄灰霉菌的方法，以番茄灰霉菌DNA为模板进行PCR反应，其特征在于，所述PCR反应体系中加入有一对特异性引物CND11F/CND11R，该特异性引物的序列分别为：

特异性引物CND11F：5’-AACCCGACTTTGGACCTG-3’，

特异性引物CND11R：5’-TTGCTTCCGATTGATTGC-3’。

2.根据权利要求1所述的方法，所述PCR反应体系终体积为20μL，其中l0×PCR buffer2μL，0.5μL浓度为15mM的MgCl₂，1.6μL浓度为2.5mM的dNTPs，5μM引物各0.5μL，5U/μL的Taq酶0.2μL，DNA模板1μL，灭菌双蒸水13.7μL，PCR反应扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

3.根据权利要求1所述的方法，所述PCR快速检测为实时荧光定量PCR检测。

4.根据权利要求3所述的方法，所述PCR反应体系中加入有SYBR Green Supermix。

5.根据权利要求4所述的方法，所述PCR反应体系总体积为20μL，SYBR GreenSupermix10μL，1μL浓度为10μM的特异性引物CND11F，1μL浓度为10μM的特异性引物CND11R，DNA模板1μL，余量为无菌双蒸水7μL，荧光定量PCR反应程序：

第1步:95.0℃3分钟，

第2步:95.0℃10秒钟，

第3步:59.0℃30秒钟，

第4步:进行第2步程序,重复39次循环，

第5步:熔解曲线65.0℃至95.0℃,每5秒钟增加0.5℃，

第6步：结束。

6.根据权利要求1所述的方法，所述番茄灰霉菌DNA来自植物叶片组织或果实。

7.一种检测番茄灰霉菌的试剂盒，包括一PCR反应体系，所述PCR反应体系中含有特异性引物CND11F/CND11R，该特异性引物的序列分别为：

特异性引物CND11F：5’-AACCCGACTTTGGACCTG-3’，

特异性引物CND11R：5’-TTGCTTCCGATTGATTGC-3’。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，所述PCR反应体系还包括荧光基团SYBR GreenSupermix。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，所述PCR反应体系为：SYBR Green Supermix 10μL，1μL浓度为10μM的特异性引物CND11F，1μL浓度为10μM的特异性引物CND11R，无菌双蒸水7μL；反应时需加入的待测番茄灰霉菌DNA模板为1μL。