[发明专利]一种重组人尿激酶原的病毒去除方法

权利要求书

1.一种重组人尿激酶原的病毒去除方法，其特征在于，所述方法包括用离子交换层析柱对重组人尿激酶原进行纯化的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法，还包括将重组人尿激酶原发酵液通过层析后获得的初步纯化液的步骤。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的离子交换层析是阴离子交换层析或阳离子交换层析或其结合。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用阴离子交换层析去除重组人尿激酶原病毒的方法，包括如下步骤：初步纯化液经过阴离子交换层析柱吸附，初步纯化液与Tris-HCl缓冲液混合，调节pH值后上样，病毒被吸附在阴离子交换层析柱上，尿激酶原被Tris-HCl缓冲液洗脱直接穿透，根据UV280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即得纯化后的重组人尿激酶原原液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，其中以阴离子填料为介质进行交换层析，层析柱采用0.015～0.025mol/L Tris-HCl平衡缓冲液pH8.0±0.5含0.05～0.20mol/L NaCl进行平衡，初步纯化液与0.02～0.035mol/L Tris-HCl缓冲液pH8.0±0.5按1：1.5-3体积比混合，调节pH值至8.0±0.5后上样，病毒被吸附在阴离子交换层析柱上，尿激酶原被0.015～0.025mol/L Tris-HCl缓冲液pH8.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl洗脱直接穿透，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化重组人尿激酶原。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用阳离子交换层析去除重组人尿激酶原病毒，其包括如下步骤：初步纯化液经过阳离子交换层析柱吸附，初步纯化液与磷酸盐缓冲液混合，调节pH值后上样，病毒被吸附在阳离子交换层析柱上，重组人尿激酶原被磷酸盐缓冲液洗脱直接穿透，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即得纯化后的重组人尿激酶原原液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，以阳离子填料为介质进行交换层析，层析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl进行平衡，纯化尿激酶原1调节pH值至6.0±0.5后上样，病毒被吸附在阳离子交换层析柱上，尿激酶原1用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲 液pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/L NaCl洗脱直接穿透，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化的重组人尿激酶原。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用阴离子和阳离子交换层析去除重组人尿激酶原病毒，包括如下步骤：初步纯化液经过阴离子交换层析柱吸附，初步纯化液与Tris-HCl缓冲液混合，调节pH值后上样，病毒被吸附在阴离子交换层析柱上，尿激酶原被Tris-HCl缓冲液洗脱直接穿透，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即得纯化后的尿激酶原1；尿激酶原1再经过阳离子交换层析柱吸附，尿激酶原1与磷酸盐缓冲液混合，调节pH值后上样，病毒被吸附在阳离子交换层析柱上，尿激酶原1被磷酸盐缓冲液洗脱直接穿透，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即得纯化后的重组人尿激酶原原液。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，以阴离子填料为介质进行交换层析，层析柱采用0.015～0.025mol/L Tris-HCl平衡缓冲液pH8.0±0.5含0.05～0.20mol/L NaCl进行平衡，初步纯化液与0.02～0.035mol/L Tris-HCl缓冲液pH8.0±0.5按1：1.5-3体积比混合，调节pH值至8.0±0.5后上样，病毒被吸附在阴离子交换层析柱上，尿激酶原1被0.015～0.025mol/L Tris-HCl缓冲液洗脱直接穿透，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化尿激酶原1；纯化尿激酶原1调节pH值至6.0±0.5后阳离子交换层析柱上样，病毒被吸附在阳离子交换层析柱上，尿激酶原1被0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液洗脱直接穿透，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化的重组人尿激酶原原液。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤如下

步骤A蛋白捕获：尿激酶原发酵液选用阳离子交换层析法得到纯化中间体1；

步骤B凝胶层析：中间体1通过凝胶层析法获得纯化中间体2；

步骤C阳离子交换层析：中间体2通过阳离子交换层析法获得纯化中间体3；

步骤D亲和层析：中间体3通过亲和层析法获得初步纯化液；

初步纯化液以阴离子填料为介质进行交换层析，阴离子填料为Streamline DEAE或DEAE Sephacel DE-52，层析柱采用0.015～0.025mol/L Tris-HCl平衡缓冲液pH8.0±0.5含0.05～0.20mol/L NaCl进行平衡，初步纯化液与0.02～ 0.035mol/L Tris-HCl缓冲液pH8.0±0.5按1：1.5-3体积比混合，调节pH值至8.0±0.5后上样，病毒被吸附在阴离子交换层析柱上，尿激酶原被0.015～0.025mol/L Tris-HCl缓冲液pH8.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl洗脱直接穿透，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化重组人尿激酶原；

或

初步纯化液以阳离子填料为介质进行交换层析，阳离子填料为SP Sepharose F.F.或SP Sephadex C-50，层析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl进行平衡，纯化尿激酶原1调节pH值至6.0±0.5后上样，病毒被吸附在阳离子交换层析柱上，尿激酶原1用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/L NaCl洗脱直接穿透，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化的重组人尿激酶原；

或

初步纯化液以阴离子填料为介质进行交换层析，层析柱采用0.015～0.025mol/L Tris-HCl平衡缓冲液pH8.0±0.5含0.05～0.20mol/L NaCl进行平衡，初步纯化液与0.02～0.035mol/L Tris-HCl缓冲液pH8.0±0.5按1：1.5-3体积比混合，调节pH值至8.0±0.5后上样，病毒被吸附在阴离子交换层析柱上，尿激酶原1被0.015～0.025mol/L Tris-HCl缓冲液洗脱直接穿透，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化尿激酶原1；纯化尿激酶原1调节pH值至6.0±0.5后阳离子交换层析柱上样，病毒被吸附在阳离子交换层析柱上，尿激酶原1被0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液洗脱直接穿透，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化的重组人尿激酶原原液。