[发明专利]钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法

权利要求书

1.一种钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，包括：

步骤一、将含有钙蛋白酶的蛋白样品的蛋白浓度调至5.83～12.5μg/μl，之后向其中加入磷酸化抗体，所述磷酸化抗体与所述含有钙蛋白酶的蛋白样品中的蛋白的总反应量的质量比为1:1750～2500，然后将含有钙蛋白酶的蛋白样品与磷酸化抗体于4℃下震荡孵育，以形成免疫复合物，再通过蛋白质免疫沉淀方法富集得到磷酸化的钙蛋白酶样品。

步骤二、通过蛋白质免疫印迹方法检测所述步骤一中得到的所述磷酸化的钙蛋白酶样品的磷酸化水平。

2.如权利要求1所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，其特征在于，所述步骤一中，通过蛋白质免疫沉淀方法富集得到所述磷酸化的钙蛋白酶样品的具体步骤包括：

1.1)取ProteinA/G琼脂糖树脂浆液并使其吸附在离心柱上，其中，所述ProteinA/G琼脂糖树脂浆液与所述钙蛋白样品的体积比为2～3:40～60，且每个离心柱内加入的所述ProteinA/G琼脂糖树脂浆液的体积为20-30μl；

1.2)将所述免疫复合物加入经过步骤1.1)处理后的吸附有所述ProteinA/G琼脂糖树脂的所述离心柱中，并于4℃恒温震荡孵育1h，之后离心，然后使用IP洗涤缓冲液洗涤所述ProteinA/G琼脂糖树脂三次，再用IP条件缓冲液洗涤所述ProteinA/G琼脂糖树脂一次，最后所述离心柱上截留的即为钙蛋白酶、磷酸化抗体和ProteinA/G琼脂糖树脂的三元复合物；和，

1.3)向步骤1.2)中截留有所述三元复合物的所述离心柱中添加还原性上样缓冲液，并于100℃下孵育5min，冷却后在室温下10000×g离心1min，所得的流穿液体即为富集的所述磷酸化的钙蛋白酶样品。

3.如权利要求1所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，其特征在于，所述步骤二中，在通过蛋白质免疫印迹方法检测所述磷酸化的钙蛋白酶样品的磷酸化水平过程中，与所述钙蛋白酶反应的第一抗体采用μ-calpain单克隆抗体，所述第一抗体的浓度为1.4-2μg/ml。

4.如权利要求3所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，其特征在于，所述步骤二中，在通过蛋白质免疫印迹方法检测所述磷酸化的钙蛋白酶样品的磷酸化水平过程中，与所述第一抗体结合的第二抗体采用anti-mouseIgG，所述第二抗体的浓度为0.1-0.3μg/ml。

5.如权利要求1至4任一所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，其特征在于，在所述步骤一之前还包括提取所述含有钙蛋白酶的蛋白样品的方法：

采集动物肌肉样品，并按照质量体积比1:6将所述动物肌肉样品加入组织裂解液或者肌浆抽提液中，将所述动物肌肉样品和所述组织裂解液于冰上匀浆至所述动物肌肉样品和所述组织裂解液形成均一的匀浆液，然后将所述匀浆液于4℃下离心收集上清液即得到所述含有钙蛋白酶的蛋白样品；且所有步骤均在冰上操作或冰浴操作；

其中，所述组织裂解液包含浓度为25mM的N-二甘氨酸和150mM的氯化钠，所述组织裂解液的pH为7.6；

所述肌浆抽提液包含浓度为100mM的Trisbase、10mM的EDTA和0.05％的巯基乙醇，所述肌浆抽提液的pH为8.3。

6.如权利要求5所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，其特征在于，所述组织裂解液中还包含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，且所述磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂均需现用现加；

所述匀浆过程在冰上进行30s，且每次匀浆时间为10s，每两次匀浆之间间隔20s。

7.如权利要求1所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，其特征在于，所述步骤一中，所述磷酸化抗体和所述含有该蛋白酶的蛋白样品的总体积为400-600μl，所述含有钙蛋白酶的蛋白样品中蛋白的总反应量为3500-5000μg。

8.如权利要求1所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，其特征在于，所述步骤一中，所述磷酸化抗体的浓度为0.2-0.3μg/μl，所述磷酸化抗体采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸泛抗单克隆抗体。

9.如权利要求1所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，其特征在于，所述步骤一中，所述含有钙蛋白酶的蛋白样品与磷酸化抗体于4℃下震荡孵育2-14h，以形成所述免疫复合物。

10.如权利要求5所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，其特征在于，所述动物肌肉样品取自羊。