[发明专利]结核分枝杆菌复合群核酸检测方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种结核分枝杆菌复合群核酸检测方法，通过使用结核分枝杆菌复合群的特异性引物，利用交叉引物恒温扩增技术对样本中的结核分枝杆菌复合群核酸的靶基因特定片段进行扩增，然后通过分子信标对靶基因特定片段进行实时荧光检测以实现结核分枝杆菌复合群的筛查检测；所述方法以枯草芽孢杆菌为内控，用于对检测进行质量监控，具体是将枯草芽孢杆菌孢子与样本混合一起进行核酸提纯、扩增和检测；所述检测方法的所有过程在同一个试剂盒中进行，实现了核酸提取和纯化、核酸扩增及检测分析三个过程的全自动一体化。

技术领域

本发明涉及一种结核分枝杆菌复合群核酸的检测技术，特别涉及一种主要应用全自动检测系统的核酸检测方法及试剂盒，适合对结核分枝杆菌复合群核酸的定性检测。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌和非洲分枝杆菌等引起的慢性传染性疾病，可累及全身各个器官，以肺结核最为多见。结核分枝杆菌主要是经空气传播，大多数人在感染结核分枝杆菌后并无症状，称为潜伏感染。潜伏感染可持续几十年，仅有5％—10％的潜伏感染者发展为活动性肺结核。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。近年来，全球结核病疫情的回升，引起了国际社会的高度重视，WHO已将结核病作为重点控制的传染病之一，并宣布全球结核病处于紧急状态。世卫组织在结核防治报告中指出，改进检测工作，可以促进国际结核病控制努力，并应对巨大的市场需求，同时呼吁对以低收入和中等收入国家为目标的新的诊断工具进行工业投资。

在结核病的细菌学检验中，通常将分枝杆菌分为结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex)和非结核分枝杆菌(Nontuberculosismycobacteria,NTM)。结核分枝杆菌复合群包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛结核分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)和田鼠分枝杆菌(M.microti)。在结核分枝杆菌复合群内各种中，除田鼠分枝杆菌对人无致病力外，其他三种菌均可对人致病，产生大致相同的临床表现。因此，临床上往往只做结核分枝杆菌复合群的鉴定而不进行亚种水平的鉴定。

目前应用于结核病诊断的实验室技术有很多种，这些常规检查方法在技术上虽然比较成熟，但目前尚存在一些问题：国际推荐的涂片和培养方法还分别存在特异性差、敏感性低和结果报出时间太长的不足，国际认可的结核菌快速培养系统虽大大提高了培养结果的报出时间，但由于仪器设备昂贵，检测成本太高而较难推广普及。PCR技术虽然具备快速、灵敏、特异等特点，但由于实验室扩增物污染极易造成假阳性结果而限制了其在临床上的广泛应用，而且其扩增检测所需要的仪器价格极其昂贵，基层单位难于常规应用。而结核病高发区主要集中于农村、边远地区及贫穷落后国家，世卫组织调查认为在全世界结核病患者或生活在结核病高危地区的人当中，大多数人都很难获得迅速而准确的检测。世卫组织控制结核司司长Mario Raviglione博士说“世界迫切需要新的、安全的和可负担得起的诊断方法，以简化病例发现过程”。因此，开发简便、快速、准确、经济，尤其适宜于基层单位推广使用的结核分枝杆菌复合群快速检测试剂及相应的检测设备成了各国企业研究的重点。

表1目前的结核分枝杆菌/结核分枝杆菌复合群检验方法汇总及其优劣势比较

专利ZL 200810134583.1公开了一种核酸序列新的扩增技术，更具体地说，涉及利用交叉引物恒温扩增靶核酸序列的方法。

发明内容

本发明的其中一个发明目的在于提出一种检测结核分支杆菌复合群的方法，不仅检测效率更高，而且检测精度也更高。

本发明的另一发明目的在于提出一种全自动一体化核酸检测试剂盒，它可以对样品进行制备(核酸提取)、核酸扩增和检测分析的全自动一体化处理，用于检测结核分枝杆复合群核酸。

为了实现本发明之目的，采用如下技术方案：