[发明专利]一种中东呼吸综合征冠状病毒的双靶基因实时荧光PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种中东呼吸综合征冠状病毒的双 靶基因实时荧光PCR检测方法。

背景介绍

当今呼吸道传染病在全球范围内广泛传播与流行，新的病种不断被发现，流行地 域不断扩展，流行的频率不断增强，对国境口岸的卫生安全造成了严重威胁，因此对呼吸道 传染病的监测是国境口岸卫生检疫的重要工作。对国境口岸来说，不仅要求对病原体“检得 出”，还要求能够“检得准、检得快”，才能满足口岸现场快速处置疫情的需要。

中东呼吸综合征是由一种新型冠状病毒(MERS-CoV)感染而引起的病毒性呼吸道 疾病，2012年在沙特阿拉伯首次被发现。冠状病毒是一组能够导致人类和动物感染发病的 病毒，能够引起人类发生从普通感冒到严重急性呼吸综合征(SARS)的多种疾病。MERS-CoV 经空气飞沫传播、通过呼吸道侵入并能引起易感人群感染和流行的呼吸道传染病，因其传 染性强，易在短时间内迅速传播，造成疫情暴发、流行或大流行，为世界卫生组织(WHO)所关 注。2015年6月广州出现中国第一例输入性MERS病例，因此对MERS的监测是全国各口岸传染 病监测的工作重点。针对口岸入境发热人员的流行病学特征，加强口岸重点人群的体温监 测和医学巡查，加大对旅行者的宣传力度，能有效防止MERS经口岸传播，保护人群健康安 全。

随着我国商贸、旅游业的快速发展,境内外人员交往日益密切,以及动物的进口等 影响,中东呼吸综合征冠状病毒输入的危险性日益增高。因此,尽快建立快速简便、特异敏 感的检测方法对防范中东呼吸综合征冠状病毒的输入具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏的中东呼吸综合征冠状病毒的 双靶基因实时荧光PCR检测方法。

本发明的中东呼吸综合征冠状病毒的双靶基因实时荧光PCR检测方法，包括如下 检测步骤：

(1)标本处理：标本混匀后用于下一步核酸提取。

(2)RNA核酸提取：利用裂解法裂解病毒，利用离心柱吸附进行核酸提取。

(3)RT-PCR扩增反应：

a.RT-PCR反应体系包括：RT-PCR反应液,两对特异性正、反向引物和两条特异性探 针混合液，逆转录酶/DNA聚合酶，RNase抑制剂，DEPC水,RT-PCR质控品,标本RNA核酸；其中， 所述的特异性引物和探针是针对N基因和E基因两个靶标的特异性引物扩增区内设计、能够 区别其他病毒株。

所述的特异性引物探针特异性引物和探针为：

E-Forward5’-GCAACGCGCGATTCAGTT-3’SEQIDNO1；

E-Reverse5’-GCCTCTACACGGGACCCATA-3’SEQIDNO2；

E-Probe5’-FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-TAMRA-3’SEQIDNO3；

N-Forward5’-GGGTGTACCTCTTAATGCCAATTC-3’SEQIDNO4；

N-Reverse5’-TCTGTCCTGTCTCCGCCAAT-3’SEQIDNO5；

N-Probe5’-VIC-ACCCCTGCGCAAAATGCTGGG-TAMRA-3’SEQIDNO6。

b.将上述混合好的反应液放入ABI7500Fast仪器内进行PCR扩增及荧光信号检测；

(4)结果判定：根据扩增结果，判定感染情况。

步骤(2)中所述的RNA提取为病毒RNA提取试剂盒提取，取140ul咽拭子标本，裂解 后，按照试剂盒说明书中的提取步骤提取RNA。

步骤(3)中所述的RT-PCR反应体系为：2XRT-PCR反应液10.0ul,引物探针混合液 1.8ul，逆转录酶/DNA聚合酶0.2ul,RNase抑制剂0.4ul，DEPCH2O3.6ul,标本核酸4.0ul。

步骤(3)中所述的RT-PCR扩增的反应条件是：45℃逆转录10min，95℃变性2min，95 ℃变性5s，60℃退火和延伸26s，40个循环。

步骤(3)中所述的探针N-Probe的荧光标记为HEX。