[发明专利]一种肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒

权利要求书

1.一种肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括以下各组分：RNA提取溶液、RNA洗脱液、内标、PCR反应液、EV/CA16/EV71酶混合液、EV/CA16/EV71阳性对照品、EV/CA16/EV71阴性对照品，其中，所述PCR反应液包括用于靶多核苷酸扩增的上下游引物EV-F、CA16-F、EV71-F与EV-R、CA16-R、EV71-R以及用于靶多核苷酸检测的探针EV-P、CA16-P、EV71-P，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针，其碱基对序列分别为：

EV上游引物EV-F：5′-GACATGGTGTGAAGAGCCTATTG-3′；

EV下游引物EV-R：5′-CGGACACCCAAAGTAGTCGG-3′；

EV探针EV-P：5′-CY5-CCCCTGAATGCGGCTAATCCTAAC-BHQ2-3’；

CA16上游引物CA16-F：5′-TATGTTAATTGGGACATTGATTTGA-3′；

CA16下游引物CA16-R：5′-ACCATTGGGTTTGGCTACG-3′；

CA16探针CA16-P：5′-FAM-ATATGCTCAGCTGCGGCGG-BHQ1-3′；

EV71上游引物EV71-F：5′-TCCCACATTCGGAGAACACA-3′；

EV71下游引物EV71-R：5′-AAGGGTACTTGGACTTGGAGGT-3′；

EV71探针EV71-P：5′-HEX-AGGAGAAAGATCTTGAATACGGGGC-BHQ1-3′。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述内标为插入pUC18T载体的长为90碱基对的人工合成DNA序列的重组体，其浓度为1.00E+03copies/ml～1.00E+06copies/ml；90碱基对的序列如下所示：

5′-CAGCTTGTTGTAACAAAGCATCCGCTCCCCCATTCATGTTGCTGGGTACAGACAGTTACCTCTCCACTAGGCAAATCTCAACAGGATCAG-3′。

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RNA提取溶液包括如下组分：

RNA提取溶液I：十二烷基硫酸钠，质量/体积0.3％～1.2％、曲拉通，体积/体积1.0％～5.0％，异硫氰酸胍0.1mol/L～1.2mol/L、50μg/ml～350μg/ml的磁珠；

RNA提取溶液II：4-羟乙基哌嗪乙磺酸150mmol/L～350mmol/L、pH6.5±0.2，氯化钠150mmol/L～400mmol/L；

RNA提取溶液III：曲拉通，体积/体积0.5％～3.0％、氯化钠100mmol/L～400mmol/L；

RNA提取溶液IV：矿物油。

4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RNA洗脱液为Tris-HCl0.5mol/L～1.5mol/L、EDTA0.2mol/L～1.5mol/L。.

5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括5×PCR反应缓冲液10μl，2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.1μmol/L～0.4μmol/L用于检测内标的上下游引物IC-F与IC-R，0.1μmol/L～0.4μmol/L用于检测内标的探针IC-P。

6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述用于检测内标的上下游引物以及用于检测内标的探针，其碱基对序列分别为：

内标上游引物IC-F：5′-CAGCTTGTTGTAACAAAGCA-3′；

内标下游引物IC-R：5′-CTGATCCTGTTGAGATTTGCC-3′；

内标探针IC-P：5′ROX-CTCCCCCATTCATGTTGCTGGG-BHQ13′。

7.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述EV/CA16/EV71酶混合液为mMLV酶10U/μl～150U/μl和H-TaqDNA聚合酶1U/μl～10U/μl。