[发明专利]一种分子改造肝靶向干扰素的方法及突变的肝靶向干扰素

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种分子改造肝靶向干扰素的方法及突 变的肝靶向干扰素。

背景技术

干扰素可通过多种途径发挥抗病毒和抗癌作用，但在应用时存在着用药剂量大、 疗效不够理想、毒副作用大等缺点，限制了其在临床中的广泛应用。这主要原因是由于病毒 性肝炎和肝癌的病灶主要在肝脏，治疗时干扰素在体内容易扩散降解，导致相对平均的组 织分布，未能在肝脏形成有效的药物浓度。为了达到临床效果，药物剂量常要加大几倍、几 十倍，药物剂量的加大也加重了其不良反应，又容易产生耐药性，从而影响疗效。将肝靶向 肽CSPI-plus与干扰素（IFN）相融合，利用肝靶向肽CSPI-plus的肝靶向特性，使干扰素在 肝脏富集，达到提高干扰素治疗肝脏疾病的特异性，减少用药量，降低毒副反应，具有良好 的应用开发前景。

但IFN-CSP是以包涵体的形式存在，需经过变性、复性等复杂制备过程才能获得有 活性的蛋白，不仅工艺复杂、最终得率不高，且由于IFN-CSP分子结构中存在两对二硫键，复 性过程中容易错误折叠，蛋白质复性效率不高，终产物的活性还有待进一步提高。

发明内容

本发明为了克服现有技术的不足，提供一种分子改造肝靶向干扰素的方法，从而 获得生物学活性更强的突变的肝靶向干扰素。

本发明的另一个目的是提供一种突变的肝靶向干扰素。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种分子改造肝靶向干扰素的方法，具体为从氨基端开始，将11位氨基酸由丝氨酸突 变成天冬酰胺、14位氨基酸由苏氨酸突变成丙氨酸、16位氨基酸由甲硫氨酸突变成异亮氨 酸、26位氨基酸由亮氨酸突变成脯氨酸、37和102位氨基酸由甘氨酸突变成谷氨酸、44位氨 基酸由甘氨酸突变成天冬氨酸、在44和45位之间插入天冬氨酸，45位氨基酸由天冬酰胺突 变成赖氨酸、51位氨基酸由谷氨酸突变成谷氨酰胺、52位氨基酸由苏氨酸突变成丙氨酸、54 位氨基酸由脯氨酸突变成丝氨酸、68位氨基酸由丝氨酸突变成苏氨酸、79位氨基酸由苏氨 酸突变成天冬氨酸、85位氨基酸由酪氨酸突变成半胱氨酸、100位氨基酸由异亮氨酸突变成 甲硫氨酸、103位氨基酸由颉氨酸突变成谷氨酸、104位氨基酸由甘氨酸突变成精氨酸、106 位氨基酸由苏氨酸突变成甘氨酸、112位氨基酸由赖氨酸突变成天冬酰胺、113位氨基酸由 谷氨酸突变成丙氨酸、120位氨基酸由精氨酸突变成赖氨酸、124位氨基酸由谷氨酰胺突变 成精氨酸、131位氨基酸由赖氨酸突变成苏氨酸、151位氨基酸由苯丙氨酸突变成亮氨酸、 160和163位氨基酸由丝氨酸突变成精氨酸。

一种突变的肝靶向干扰素，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，原始肝靶向干扰素 的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。

一种突变的肝靶向干扰素的编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:3或4所示。SEQ IDNO:3为突变的肝靶向干扰素的编码基因密码子未优化前的序列，SEQIDNO:4为突变的 肝靶向干扰素的编码基因经大肠杆菌密码子优化后的序列。

优选地，本发明进一步保护含有SEQIDNO:3或4所述编码基因的重组载体。更优 选地，所述重组载体的构建方法为在目的载体如pMD19-T载体或表达载体pET21b的多克隆 位点插入SEQIDNO:3或4所述编码基因。

另外，本发明还进一步保护SEQIDNO:2所述突变的肝靶向干扰素在制备抗病毒 和抗癌药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明重组突变肝靶向干扰素的活性为1×10⁹IU/mg，显著高于原始肝靶向干扰素的 活性（1.2×10⁸IU/mg）。重组突变肝靶向干扰素每4000万IU中的内毒素含量小于0.25EU， 远低于中国药典中规定的每300万IU应小于10EU。而且，重组突变肝靶向干扰素的活性明显 强于普通重组突变干扰素。

附图说明

图1为原始肝靶向干扰素与突变肝靶向干扰素氨基酸序列比对结果。

图2为原始肝靶向干扰素与突变肝靶向干扰素的结构比对。

图3为原始肝靶向干扰素与突变肝靶向干扰素的稳定性分析。

图4突变肝靶向干扰素核苷酸序列大肠杆菌稀有密码子分析结果。

图5突变肝靶向干扰素核苷酸序列密码子优化结果。