[发明专利]一种构建高产丁醇菌株的方法与应用

权利要求书

1.一种构建重组菌的方法，为抑制或沉默生产丁醇的出发菌的基因组上的丙酮酸激酶pykA基因表达，得到重组菌；所述生产丁醇的出发菌为大肠杆菌突变体EB216 CGMCCNo.11590。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述抑制或沉默生产丁醇的出发菌基因组上的丙酮酸激酶pykA基因表达为敲除生产丁醇的出发菌基因组上的丙酮酸激酶pykA基因。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述敲除生产丁醇的出发菌基因组上的丙酮酸激酶pykA基因采用λ-red同源重组系统、sacB基因介导筛选的同源重组或CRISPR/Cas系统。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述敲除生产丁醇的出发菌基因组上的丙酮酸激酶pykA基因为采用λ-red同源重组系统将生产丁醇的出发菌基因组上的丙酮酸激酶pykA基因替换为FRT；

所述FRT的核苷酸序列为序列5第59-106位。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述丙酮酸激酶pykA的氨基酸序列为序列表中序列1。

6.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述丙酮酸激酶pykA基因pykA的核苷酸序列为序列3。

7.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述抑制或沉默生产丁醇的出发菌的基因组上的丙酮酸激酶基因表达包括如下步骤：

1）将含有丙酮酸激酶基因pykA的上游同源臂、抗性基因和丙酮酸激酶基因pykA的下游同源臂的DNA分子导入EB216/pKD46，得到pykA替换为两端带有FRT的卡那霉素抗性基因片段的中间菌；

所述EB216/pKD46为将质粒pKD46导入EB216中得到的菌；

2）将质粒pCP20转入所述中间菌，使所述pCP20质粒上的FRT替换了中间菌中的卡那霉素，得到去除卡那霉素的中间菌；

3）将所述去除卡那霉素的中间菌先在37℃培养去除了温敏质粒pCP20和pKD46，得到去除温敏质粒的中间菌；

4）将所述去除温敏质粒的中间菌分别在卡那霉素抗性培养基、氯霉素抗性培养基、无卡那霉素且无氯霉素平板培养基中培养，选取只在所述无卡那霉素且无氯霉素平板培养基上生长，且在所述卡那霉素抗性培养基和所述氯霉素抗性培养基均不生长的菌，为重组菌；

所述两端带有FRT的卡那霉素抗性基因片段的核苷酸序列为序列5第41-1534位；

所述丙酮酸激酶基因pykA的上游同源臂为序列5第1-40位；

所述丙酮酸激酶基因pykA的下游同源臂为序列5第1535-1574位。

8.由权利要求1-7中任一所述方法制备的重组菌。

9.权利要求1-7中任一所述方法或权利要求8所述重组菌在生产丁醇或提高丁醇产量中的应用。

10.一种生产丁醇的方法，发酵权利要求8所述重组菌，得到丁醇。