[发明专利]兔中型艾美耳球虫荧光定量PCR检测引物和试剂盒

说明书

本发明涉及检测技术领域，具体公开了兔中型艾美耳球虫荧光定量PCR检测引物和试剂盒，所述引物为Me‑F和Me‑R，其序列如SEQ ID NO：1～2所示，基于所述引物优化反应体系和反应条件，研制出一种基于荧光染料法的定量检测兔中型艾美耳球虫荧光定量PCR试剂盒，试剂盒操作简单程序化，方法特异性强，敏感性高，结果判定客观。该方法可实现对兔球虫病的流行病学调查及临床诊断，为兔球虫的诊断和防治技术，临床快速而准确的检测兔球虫的感染情况提供技术支持。

技术领域

本发明涉及检测技术领域，更具体地，涉及兔中型艾美耳球虫荧光定量PCR检测引物和试剂盒。

背景技术

兔球虫病是一类由兔艾美耳球虫寄生于家兔肝胆管和肠道上皮细胞内所引起的一种最常见的原虫性疾病。该病危害严重，流行广泛，感染率高，对养兔业的危害极大，每年造成巨大的经济损失，呈世界分布，据报道1～3月龄的幼兔感染率可达100％，患病后幼兔的死亡率高达70％左右，在我国很多地区也均有感染报道。该病病原种类多达11个种，分别是斯氏艾美耳球虫(Eimeria stiedai)、穿孔艾美耳球虫(Eimeria perforans)、大型艾美耳球虫(Eimeria magna)、梨型艾美耳球虫(Eimeria piriformis)、肠艾美耳球虫(Eimeriaintestinalis)、维氏艾美耳球虫(Eimeria vejdovskyi)、中型艾美耳球虫(Eimeriamedia)、无残艾美耳球虫(Eimeria irresidua)、小型艾美耳球虫(Eimeria exigua)、黄艾美耳球虫(Eimeria flsvescens)和盲肠艾美耳球虫(Eimeria coecicola)。其中流行病学调查显示中型艾美耳球虫流行广泛。

目前常用的诊断方法是饱和盐水漂浮法，浮卵后通过显微镜检测粪便中的卵囊。兔球虫呈混合感染，各个虫种卵囊之间的形态特征不是十分明显，增加了临床操作人员鉴别诊断的难度。因此建立一种准确、简便、快速的兔球虫鉴别诊断方法意义重大。

实时定量PCR(Real-time PCR)技术在PCR反应体系中加入荧光基团，以荧光信号的强度实时监测整个PCR反应的进程，最后达到对未知模板进行定量分析的方法。反应体系中加入荧光基团后，随着反应的每一步扩增荧光信号逐渐增强，这些荧光信号可以被仪器设备实时地采集、分析，同时绘制出一条循环反应数与荧光信号强度的标准曲线。PCR反应初期产生的荧光信号弱，当DNA扩增进入指数期，产生的荧光信号越来越强，达到能被检测到的水平，因此选取DNA指数扩增期的某一点来检测PCR产物的量，由此来推断模板最初的含量，达到对模板的定量检测。常用的有SYBR Green I染料法和TaqMan探针法，SYBR GreenI法成本低、操作简便，虽然其特异性不如TaqMan探针法，但使用特异性高的引物，优化反应体系与条件，消除非特异性扩增和二聚体的生成，也能达到很高的特异性。SYBR Green I能结合到dsDNA小沟部位，是一种具有绿色激发波长的染料，它只有与dsDNA结合才会发出荧光，在变性时，DNA双链分开，不产生荧光，在复性和延伸时，形成dsDNA，SYBR Green I发出荧光。与普通PCR相比，荧光定量PCR具有灵敏、精确、简单、快速等优点，在PCR的扩增及分析过程均在同一封闭系统下完成，只需一次打开PCR反应管，避免交叉污染导致假阳性的产生，被广泛的应用于各种临床病原的检测。

ITS序列是位于核糖体DNA序列中的一段内转录间隔区序列，ITS序列不同于其两端的大小亚基基因，ITS区不加入成熟的核糖体，功能上不受限制，受到的选择压力较小，导致其在核苷酸长度和序列上出现了很大的变异。特别适合作为种间分类鉴定的分子标记，已广泛应用于寄生虫病原的分类鉴定研究上。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中兔球虫病检测所存在的缺陷，提供一种针对兔中型艾美耳球虫病的荧光定量PCR检测引物对。

本发明的第二个目的是提供含有所述检测引物的检测试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：