[发明专利]分离胎盘造血干细胞的灌洗液、酶解液及方法

权利要求书

1.分离胎盘造血干细胞的酶解液，其特征在于，包含RPMI-1640培养基、胶原酶Ⅷ、胰酶、肝素钠、酚妥拉明、维生素C和Z-VAD-FMK；

所述酶解液各组分在RPMI-1640培养基中的含量为：0.01～0.05mg/mL胶原酶Ⅷ、0.01～0.05mg/mL胰酶、10～50U/mL肝素钠、0.01～0.1mg/mL酚妥拉明，1～5mg/mL维生素C、5～20ng/mL Z-VAD-FMK。

2.根据权利要求1所述的分离胎盘造血干细胞的酶解液，其特征在于所述酶解液各组分在RPMI-1640培养基中的含量为：0.05mg/mL胶原酶Ⅷ、0.025mg/mL胰酶、25U/mL肝素钠、0.1mg/mL酚妥拉明，3mg/mL维生素C、10ng/mL Z-VAD-FMK。

3.分离胎盘造血干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、用灌洗液清洗胎盘内血液；

S2、向胎盘内灌注权利要求1-2任一项所述的酶解液，室温酶解0.5～1.5h；

S3、收集酶解后的酶解液，离心取细胞沉淀；

S4、用羟乙基淀粉溶液重悬细胞沉淀，室温下静置20～40min，取上层液体离心后弃去上清；用红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温下裂解残留的红细胞5～15min，离心后弃上清；

S5、用RPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，离心后弃上清，所得细胞沉淀即为胎盘造血干细胞。

4.根据权利要求3所述的分离胎盘造血干细胞的方法，其特征在于，所述灌洗液包含缓冲液、双抗、血管扩张剂和抗氧化剂。

5.根据权利要求4所述的分离胎盘造血干细胞的方法，其特征在于，所述灌洗液中各组分在PBS中的含量为：1×～3×青-链霉素双抗，0.01～0.1mg/mL酚妥拉明，1～5mg/mL维生素C。

6.根据权利要求3所述的分离胎盘造血干细胞的方法，其特征在于，所述步骤S3在收集酶解后的酶解液后，用灌洗液灌注冲洗胎盘，收集灌洗液并与收集的酶解后的酶解液合并为混合液，混合液离心后取细胞沉淀。

7.根据权利要求3所述的分离胎盘造血干细胞的方法，其特征在于，所述步骤S4中用PBS重悬细胞沉淀，再添加1～3倍体积的羟乙基淀粉溶液，室温下静置20～40min；取上层液体300～800g离心5～10min；离心后弃去上清；用1×红细胞裂解液重悬细胞沉淀，细胞沉淀与1×红细胞裂解液的体积比为1:5～1:10，涡旋振荡，室温下裂解残留的红细胞10min，200～500g离心5～10min，离心后弃上清；所述步骤S5中用20～40mL RPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，200～500g离心5～10min，离心后弃上清，所得细胞沉淀即为胎盘造血干细胞。

8.根据权利要求3所述的分离胎盘造血干细胞的方法，其特征在于，胎盘浸没于胎盘保存液中在0～4℃条件下保存运输，6～12小时内分离胎盘造血干细胞；所述胎盘保存液包含青-链霉素双抗、肝素钠、低分子右旋糖酐和PBS，各组分在PBS中的含量为：1×～3×青-链霉素双抗、10～50U/mL肝素钠、1m/v％低分子右旋糖酐。