[发明专利]一种低抗凝肝素、其低聚糖及其制备方法和在制备抗阿尔兹海默症的药物中的应用

权利要求书

1.一种低抗凝肝素，其特征在于：所述低抗凝肝素以猪肠粘膜粗品肝素为原料，通过软骨素酶酶解、盐酸沉淀、乙醇沉淀和纯化而得，其分子量在10-20kDa之间，每个二糖单元含有1.5-2.5个硫酸基团。

2.根据权利要求1所述的低抗凝肝素，其特征在于所述低抗凝肝素含有的8种不饱和二糖即△UA-GlcNAc、△UA-GlcNS、△UA-GlcNAc6S、△UA2S-GlcNAc、△UA-GlcNS6S、△UA2S-GlcNS、△UA2S-GlcNAc6S和△UA2S-GlcNS6S的含量分别在9.5-11.5%、6.4-8.3%、5.7-7.2%、2.2-3.5%、8.8-10.4%、12.0-13.9%、0.5-1.7%和46.3-50.2%之间。

3.根据权利要求1或2所述的低抗凝肝素的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1)软骨素酶ABC酶解除去硫酸软骨素和透明质酸杂质：将猪肠粘膜粗品肝素溶解于酶解缓冲液中，离心去除不溶性杂质，加入过量的软骨素酶ABC，25~40℃摇床中反应4-6h后，煮沸使酶灭活；

(2)盐酸沉淀除去核酸杂质：将步骤(1)所得酶解液离心，向上清液中加入1-2M盐酸沉淀，离心去除核酸杂质，上清液用NaOH溶液中和至pH6.5-7.5；

(3)乙醇沉淀：向步骤(2)溶液加入0.5-3倍体积的95%乙醇沉淀，离心后取沉淀,加蒸馏水复溶后对蒸馏水透析，透析内液减压浓缩干燥后得低抗凝肝素粗提物；

(4)粗品纯化：将步骤(3)所得低抗凝肝素粗提物用蒸馏水溶解，以0.5-1.5M氯化钠水溶液为流动相，经过强阴离子交换树脂分离纯化，硫酸苯酚法检测，合并收集含有低抗凝肝素组分，对蒸馏水透析，减压浓缩、冻干，得到高纯度低抗凝肝素。

4.根据权利要求3所述的低抗凝肝素的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中酶解缓冲液包括0.05mol·L^-1乙酸铵和2mmol·L^-1氯化钙。

5.权利要求1或2所述的低抗凝肝素降解后制得的低抗凝肝素低聚糖，其特征在于所述低聚糖由所述低抗凝肝素采用肝素酶降解法或β-消除法制备而得，所述低抗凝肝素低聚糖分子量在1-7kDa之间，每个二糖单元含有1.5-2.5个硫酸基。

6.根据权利要求书5所述的低抗凝肝素低聚糖，其特征在于：所述肝素酶降解法的步骤为：将所述低抗凝肝素溶于酶解缓冲液中配成0.5-2.0wt%的溶液，加入2-10U/g的肝素酶于30-38℃反应4-48h，经SephadexG10柱脱盐，减压浓缩、冻干，得到酶法制备的所述低抗凝肝素低聚糖。

7.根据权利要求书5所述的低抗凝肝素低聚糖，其特征在于：所述β-消除法的步骤为：

（1）将所述低抗凝肝素溶于水配成15-25mg/mL的水溶液，加入低抗凝肝素0.5-3倍重量的苄索氯铵，经乙醇沉淀、干燥得到低抗凝肝素-苄索氯铵盐；

（2）将低抗凝肝素苄索氯铵盐溶于二氯甲烷配制浓度为10-15mg/mL的溶液，加入低抗凝肝素-苄索氯铵盐0.5-0.8倍重量的氯化苄，25-40℃反应10-15h，加入2-2.5倍料液体积的乙醇，收集沉淀得到低抗凝肝素苄酯；

（3）将低抗凝肝素苄酯配成15-20mg/mL的水溶液，加入终浓度为0.4-0.8mol·L^-1的NaOH溶液，40-80℃搅拌反应0.5-2h，用1mol·L^-1的盐酸调pH至7.0，加入乙醇，收集沉淀，加水溶解后经SephadexG10柱脱盐，冷冻干燥得β-消除法制备的所述低抗凝肝素低聚糖。

8.权利要求书1或2所述的低抗凝肝素在制备抗阿尔兹海默症药物中的应用。

9.权利要求5-7任一项所述的低抗凝肝素低聚糖在制备抗阿尔兹海默症的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的低抗凝肝素低聚糖在制备抗阿尔兹海默症的药物中的应用，其特征在于：所述低抗凝肝素低聚糖分子量在1kDa以上，且抗阿尔兹海默症活性与其分子量大小呈正相关。