[发明专利]来源于嗅粘膜神经元细胞分离制备技术

说明书

来源于嗅粘膜神经元细胞分离制备技术本发明提供了一种嗅粘膜神经元的分离培养、传代、冻存、分化技术。特色步骤包括：1、嗅粘膜神经元基础培养基的配置；2、原代培养技术；3、专用传代培养基的配置：收集处理培养基上清液，用于配置嗅粘膜神经元传代培养基；4、重复传代培养技术；5、冻存保护液的配置；收集处理培养基上清液，用于配置嗅粘膜神经元细胞冻存液；6、超低温冷冻保存；7、细胞复苏分化技术。本专利选取上鼻甲三分之一嗅区粘膜进行分离培养增殖、冻存、分化，并获得大量高纯度的嗅粘膜神经元细胞，目前大量基础和临床实验结果证明，该细胞具有综合神经修复作用，能有效改善神经系统疾病和损害患者的神经损伤功能和生存质量。

技术领域：本发明属于细胞培养技术领域，涉及嗅粘膜神经元细胞的分离培养、传代扩增、超低温冻存、分化技术

发明背景：嗅神经元（Olfactory neurons）在神经系统中嗅觉系统非常独特，嗅神经元位于鼻中隔上1/3的中分及邻近的两侧上鼻甲为细胞呈梭形、双极细长突起、三极细长突起、多边形.两端分别通向纤毛和集成嗅丝穿过筛孔进入嗅球。嗅神经元细胞在自然更新或者受损后，新的神经元细胞能很快生长代替，维持嗅神经传导通路和功能完整性。嗅神经元是目前所发现神经系统中可以再生的细胞之一，具有终身再生功能。嗅神经元和嗅球嗅鞘细胞由原始外胚层的嗅板(olfactory placode)发育分化而来，其生物学特性包括免疫组织化学染色阳性标记物为S100、P75(L-NGFR)等。嗅神经元能够释放多种神经营养因子、神经粘附分子，是神经系统中再生能力最强的神经元细胞，具有重要的损伤神经修复（包括替代、再生）和功能重建作用，是中枢神经修复治疗的理想候选细胞之一。由于目前很难获得大量纯度较高的嗅神经元，因此现阶段该细胞无法在临床治疗上大范围推广应用。本专利具有以下优点：1、嗅神经元细胞在体内可以终生再生。2、可通过简单的鼻腔粘膜活检获得。3、提取部分嗅粘膜对嗅觉功能无影响。4、可以进行自体移植，无免疫排斥。5、不受伦理道德约束。6、临床实验研究证明，安全有效，能提高患者生存质量。因此有很好的应用前景，可广泛应用于神经疾病和损害的临床神经修复治疗和药品开发研究等领域。

发明内容：本发明涉及嗅粘膜神经元细胞的基础培养基、原代细胞培养、重复传代培养基、重复传代培养、冻存保护液、分化。

本发明是采用以下步骤进行的技术方案：

步骤1：嗅粘膜嗅神经元基础培养基的配置：用含DMEM/DF12、IL-2、胰岛素、T3、EGF、FGF、N2、B27、PDGF、NGF、TGF-β2、BDNF、GDNF、BSA 神经营养生长因子配置。

步骤2：培养瓶包被：用多聚赖氨酸包被培养瓶。

步骤3：嗅粘膜取材：选取上鼻甲三分之一嗅区粘膜。

步骤4：原代培养：将嗅粘膜置于青链霉素与嗅粘膜嗅神经元基础培养基配比1:1中，反复冲洗血迹，用眼科剪剪成1MM左右的块，加入基础培养基混匀，转移至事先包被的培养瓶中使其贴壁，在避光37℃，5％CO2培养箱中培养，获取单个细胞。

步骤5：专用传代培养基的配置：收集处理要传代细胞培养基的上清液，加入嗅粘膜嗅神经元基础培养基配成0.5∶1。

步骤6：重复传代培养：按照1∶3进行重复传代，收集原代培养获取的单个嗅神经元细胞，加入传代培养基制成细胞悬液，转移至事先包被过的培养瓶中，在避光37℃，5％CO2培养箱中培养。

步骤7: 冻存保护液的配置：收集处理要冻存细胞的培养基上清液，用于配置细胞专用冻存液（人血白蛋白、细胞培养上清液、DMEM/F12、DMSO）。

步骤8：超低温冷冻保存：收集细胞，按照比例加入冻存保护液，按常规程序冷冻保存。

步骤9：复苏分化培养：常规复苏冻存细胞后，用配制的神经元分化培养液培养。