[发明专利]基于液相色谱串联质谱技术测定多种动物源性肉类的方法

权利要求书

1.基于液相色谱串联质谱技术测定多种动物源性肉类的方法，其特征在于，包括样品前处理，各种标准肉样特征多肽的筛选以及高效液相色谱-质谱联用检测待测肉样中的特征多肽的步骤；

其中，羊肉、鸭肉、牛肉、猪肉、鸡肉的多肽信息分别如下：

样品前处理包括以下步骤：

1)提取样品总蛋白：将待测肉样剪碎或分割成小块，向2g样品中加入5mL提取液，冰水浴均质1min，再用5mL提取液洗刀头合并，12000r/min离心20min，取上清液；

2)还原及烷基化：取100μL上清液，加入50mmol/L二硫苏糖醇溶液10μL，56℃振荡反应1h，放置室温，加入100mmol/L碘乙酰胺溶液20μL，暗处反应30min，再加入50mmol/L二硫苏糖醇溶液15μL，暗处反应15min；

3)酶切：向上述反应体系中加入25mmol/L Tris-HCl，pH 8.0缓冲溶液750μL，然后加入20μg胰蛋白酶，调节pH为8.0，37℃反应过夜；向酶解液中加入0.4％TFA终止反应，并加入1mL水，所得溶液用于过柱除盐；

4)过柱除盐：将步骤3)所得溶液用C₁₈固相萃取柱除盐，收集洗脱液过0.22μm滤膜，准备上机；

其中，步骤1)中所述提取液为0.05mol/L Tris-HCl+7mol/L尿素+2mol/L硫脲，pH 8.0；

步骤4)中依次用乙腈、50％乙腈/水、0.1％TFA活化C₁₈固相萃取柱，将步骤3)所得溶液上样，再依次用0.1％TFA，0.5％乙酸清洗，最后用1mL 60％乙腈+0.5％乙酸洗脱；

利用Easy nLC 1000液相色谱系统和Q Exactive HF质谱仪检测并筛选各种标准肉样中的特征多肽，具体步骤如下：

色谱条件：C₁₈色谱柱内径75μm，流动相：A相为0.1％FA；B相为0.1％ACN；色谱梯度为：0min，3％B相；2min，8％B相；48min，22％B相；53min，40％B相；55min，80％B相；59min，80％B相；61min，0％B相；65min，0％B相，进样量为10μL，每个样品至少采集三次数据；

质谱条件：喷雾电压2100V，毛细管温度275℃，Full Scan分辨率60000，扫描质量范围为350～1600，AGC值为1E6，IT时间为50ms，二级扫描，topN为30，分辨率为15000，AGC值为1E5，IT时间为60ms，NCE为27；

质谱数据分析：用Maxquant对各种标准肉样进行非标记定量分析，检索Uniprot数据库，最多漏切位点设为2，可变修饰为Oxidation,Acetylation，固定修饰为Carbamidomethyl；选择异亮氨酸等于亮氨酸设置，peptide for quantitation选择all，其他参数为默认值；利用非标记定量的结果，选取每个物种中独有的多肽信息，去掉含有MissCleavage的多肽，获得相对特异性多肽，即各种标准肉样的特征多肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，高效液相色谱-质谱联用检测待测肉样中的特征多肽，并与标准肉样的特征多肽进行比较，从而判定对应的肉样组分，具体步骤如下：

液质联用三重串联四极杆质谱仪进行检测：

色谱条件：色谱柱Hypersil GOLD C₁₈，规格2.1mm×100mm，1.9μm；流速0.2mL/min；柱温40℃，进样量50μL；流动相：A相0.1％FA/H₂O，B相0.1％FA/ACN，色谱梯度为：0～0.2min，3％～10％B；0.2～16min，10％～40％B；16～17min，40％～80％B；17.5～18.5min，80％～3％B；

质谱条件：喷雾电压3500V；鞘气38Arb；辅气15Arb；离子传输管温度275℃；离子源雾化温度380℃；传输线温度275℃；离子源温度380℃；采集周期为0.3s；碰撞气为1.5mTorr；Q1和Q3分辨率均为0.7；

通过对每个物种的特征多肽进行母离子扫描以及SRM扫描，根据保留时间，多个定性离子匹配以及丰度信息，最终判定对应的肉样组分。