[发明专利]一种猪肠道上皮细胞系及其应用

说明书

本发明涉及一种猪肠道上皮细胞系及其应用，属于生物技术领域。本发明的猪上皮细胞系，其保藏号为：CGMCC NO.11496。本发明构建的能稳定传代的猪肠道上皮细胞系对PEDV高度敏感、PEDV感染的毒价可以达到10^4.9TCID₅₀/mL以上，在流行毒株培养方面优于Vero细胞。能用于PEDV的分离和培养，也能用于PEDV细胞受体和致病机制的研究。PEDV易感的猪肠道上皮细胞系的建立，避免了原代猪肠道上皮细胞制备繁琐、稳定性差、难于培养的一系列缺点，为PEDV的培养提供了一个备选细胞系，为PEDV的深入研究提供了靶细胞，对PEDV疫苗生产具有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种猪肠道上皮细胞系及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻和食欲下降为基本特征，各种年龄的猪均易感。猪流行性腹泻病毒(PEDV)为冠状病毒科冠状病毒属的成员。病毒形态略呈球形，有囊膜，囊膜上有花瓣状纤突，呈皇冠状。PEDV核酸为线性单股正链RNA，长为27000～33000个核苷酸(nt)。该病毒不能凝集人、兔、猪、鼠、犬、马、羊、牛的红细胞。对外界抵抗力弱，对乙醚、氯仿敏感，一般消毒药物都可将其杀灭。病毒在60℃ 30min，可失去感染力，但在50℃条件下相对稳定。病毒在4℃，pH 5.0～9.0或在37℃，pH 6.5～7.5时稳定。

2010年以来，全国大部分地区的猪场开始大规模爆发PED，这次爆发中初生仔猪死亡率达90%，全国仔猪死亡估计有上千万头。给我国养猪业造成巨大的经济损失们，已经引起政府和社会的高度关注。当前PEDV的研究主要在猴源的Vero细胞上开展，利用非猪源细胞进行研究，得到的研究结果不能够真实的反映自然宿主细胞的感染状况。猪肠道上皮细胞为PEDV的靶细胞，国内外尚无猪肠道上皮细胞系细胞，因此每次实验均需从肠道重新分离培养，制备过程繁琐，代价高，且不能保证不同批次之间的稳定性。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术中的空白，建立一种稳定传代的猪肠道上皮细胞系（Porcine small intestinal epithelial cell line，PIEC）及其应用。

技术方案

一种猪肠道上皮细胞系，其保藏号为：CGMCC NO.11496。该猪肠道上皮细胞系能用于PEDV的分离和培养。PEDV感染的毒价可以达到10^4.9TCID₅₀/mL以上。

本发明的猪上皮细胞系是通过下述方式获得的：

在人源293细胞中扩增全长的Tert分子cDNA。将扩增产物连入PLV-puro慢病毒表达载体，构建重组表达载体P-TERT。将构建好的重组表达载体P-TERT与包装辅助质粒pSPAX2和pMG2G共转染人源293细胞，获得重组慢病毒。将该重组慢病毒侵染原代猪上皮细胞，通过嘌呤霉素加压筛选，从而获得了一株可稳定传代的猪肠道上皮细胞系。

通过PEDV 流行毒株MY1401感染实验，证实本发明的猪肠道上皮细胞系对PEDV高度敏感、PEDV感染的毒价可以达到10^4.9TCID₅₀/mL以上，在流行毒株培养方面优于Vero细胞。所以，本发明的猪肠道上皮细胞系能够用于PEDV的分离和培养，也可以用于PEDV细胞受体和致病机制的研究。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：