[发明专利]一种皮肤细胞损伤修复试剂的制备方法

权利要求书

1.一种皮肤细胞损伤修复试剂的制备方法，其特征在于：由下列步骤组成：

①取足月健康胎儿脐带，用胶体金、荧光定量PCR相结合的方法检测脐带血清HbsAg，抗-HCV，HCV-RNA,抗-HDV，抗HEV，抗-HIV-1/2，HIV-1-RNA,CMV-DNA，检测结果均为阴性的脐带方可使用；

②将脐带从采集瓶中取出，置于无菌平皿中，用无菌手术剪剪成5cm左右的小段；

③将脐带段浸没于无菌烧杯中，用PBS反复清洗残留在血管内的血液，直至清洗后的PBS基本无色为止；

④将清洗后的脐带转移到弯盘中，使用手术剪或手术刀将其剪切成1-5mm的小块，均匀平铺到T75培养瓶底部；

⑤将平铺好脐带组织块的培养瓶放入二氧化碳培养箱内，干燥30分钟；

⑥往培养瓶中缓慢加入含10％胎牛血清添加物的DMEM/F-12培养基，培养基的用量以刚刚浸没组织块为宜；

⑦每6天换液1次，期间观察组织贴块边缘细胞生长情况，待大多数组织块细胞爬出且每个块组织块周围的细胞生长至80％左右融合时，进行脐带间充质干细胞的原代传代；

⑧将间充质干细胞细胞传至P4代时，按8000cells/cm²的密度接种于T75培养瓶中，加入10mlDF12完全培养基；

⑨待细胞长至80％左右融合时，用5mLPBS缓冲液冲洗细胞表面3次；

⑩吸尽PBS缓冲液，加入10mLDF12培养基继续培养72小时；

收集培养72小时后的脐带间充质干细胞培养上清，将上清收集到50mL离心管内；

300g，室温离心5分钟；

弃沉淀，收集干细胞培养上清液，用3KD的超滤管对干细胞上清进行浓缩，浓缩10倍，获取含有3KD以上分子量的有效干细胞分泌混合因子；

将浓缩后的干细胞分泌混合因子用0.22μm的滤膜进行过滤，置于无菌瓶中，-20℃保存；

在干细胞分泌混合因子添加5g海藻糖；

在干细胞分泌混合因子添加1mg透明质酸，获得皮肤细胞损伤修复试剂。

2.根据权利要求1所述的皮肤细胞损伤修复试剂的制备方法，其特征在于：所述海藻糖加入浓度为：5wt％。

3.根据权利要求1所述的皮肤细胞损伤修复试剂的制备方法，其特征在于：所述透明质酸加入浓度为：1mg/mL。