[发明专利]一种抗人Delta-like 4人源化抗体及其制备与应用

说明书

本发明提供了一种抗人DLL4（delta‑like 4）人源化单克隆抗体H3L2及其制备方法和应用。本发明利用生物信息学软件设计鼠单克隆抗体基于CDR移植的FR区重要碱基回复突变型人源化抗体，该抗人DLL4人源化抗体重链可变区具有SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列。本发明人源化抗体H3L2可以高亲和力的结合人DLL4抗原（KD值2.26×10‑12M），能特异性靶向HUVEC细胞表面的DLL4抗原，阻断DLL4对HUVEC细胞增殖的抑制作用，保留了亲本鼠单克隆抗体的生物学活性。本发明为诊断和治疗以DLL4过量表达为特征的疾病提供了基于抗体的疗法。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种抗人Delta-like 4人源化抗体H3L2及其制备与应用。

背景技术

信号通路

Notch通路是一条保守的信号转导途径，在多种组织和器官的早期发育过程中，对细胞的发育、生长及凋亡起着重要的调控作用。肿瘤干细胞生物学研究发现，Notch信号通路在肿瘤干细胞维持肿瘤的生长中发挥着关键的作用，在许多血液癌和实体瘤中发现了Notch 信号通路的异常激活。血管内皮细胞表达两种Notch受体（Notch-1和Notch-4），以及除了DLL-3外的所有配体。其中DLL4是内皮细胞特异性配体，其介导的Notch-1信号通路对血管生成、发育起重要作用。许多血管生成信号因子（如VEGF）可以激活Notch-1/DLL4信号通路，激活的Notch-1/DLL4信号通路又会负反馈的下调VEGF受体VEGFR2的表达，从而抑制内皮细胞增殖和血管出芽。阻断DLL4介导的Notch-1信号通路则会引起内皮细胞增殖、血管过度出芽，产生管腔发育不完整的无功能血管，达到抑制肿瘤生长的效果。除此之外，还可以抑制肿瘤干细胞的增殖和自我更新，进一步防止肿瘤的生长和复发。

目前，靶向notch信号通路的临床研究药物主要有两大类，阻断γ-分泌酶的小分子抑制剂（GSI）以及靶向notch受体、配体的单克隆抗体。大部分的GSI通过结合γ-分泌酶复合物的活性切割位点，从而竞争性的抑制γ-分泌酶对notch受体的切割，达到阻断notch信号通路的作用。然而GSI对notch的抑制是非选择性的，它可以抑制所有notch受体的切割，引起胃肠道的毒副作用。同样，靶向notch1、notch2受体的单克隆抗体也会引起严重的胃肠道毒副作用。介导肠上皮细胞notch信号通路的配体主要是DLL1和DLL4，选择性的阻断DLL4介导的notch信号通路不仅可以达到抑制肿瘤的作用，还可以提高靶向特异性，减少对正常组织的毒副作用。

抗体人源化手段

鼠源单克隆抗体具有亲和力高、特异性强的优势，但是应用于人体还有很大的缺陷如：1 血清中半衰期短；2 仅有部分不同亚类的抗体能引发效应功能；3 最大的障碍是诱发HAMA反应。目前克服这些困难的首选途径是鼠单克隆抗体的人源化。最早的抗体人源化手段是将鼠单抗的可变区和人抗体的恒定区组成嵌合抗体，由于这两部分在空间结构上相对独立，其抗原亲和力保持得很好，同时免疫原性也得到了下降，但由于嵌合抗体上还保留着鼠可变区，应用于临床应用时仍可能发生强烈的HAMA反应。在此基础上，进一步将鼠单抗可变区中相对保守的FR区替换成人的FR，仅保留抗原结合部位CDR区，即CDR移植。然而起支架作用的FR不仅提供了CDR的空间构象环境，有时还参加抗体结合位点正确构象的形成。因此，简单的CDR移植往往丧失或降低了原抗体的亲和力。近年发展起来的噬菌体抗体库技术通过PCR扩增人抗体的全套可变区基因，通过噬菌体表面展示技术，把Fab或单链抗体（ScFv）表达在噬菌体的表面，经过吸附-洗脱-扩增过程筛选并富集特异性抗体。噬菌体抗体库技术筛选的抗体虽然为全人源的，但是相对于鼠源抗体亲和力和特异性仍不高。