[发明专利]中华绒螯蟹呼肠孤病毒RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及水生动物检测领域，特别涉及一种中华绒螯蟹呼肠孤病毒RT-LAMP检 测试剂盒及其检测方法。

背景技术

中华绒螯蟹颤抖病(tremordisease，TD)，又称抖抖病，中华绒螯蟹呼肠孤病毒 (Eriocheirsinensisreovirus，EsRV)是中华绒螯蟹颤抖病的主要病原，自从1994年在江 苏省被首次报道以来，随后传播至安徽、浙江、湖北等主要中华绒螯蟹养殖地。病蟹的主要 症状表现为步足出现明显的颤抖现象,指节变红并伴有肝部糜烂、鳃丝略黑、三角膜水肿等 特征，死亡率高达70％以上，对中华绒螯蟹养殖业造成极大的危害。该病主要以预防为主， 提早发现该病并采取有效的预防措施防止大面积感染。因此，需要建立一种有效、快速、简 便的EsRV病原的检测方法。

研究表明，中华绒螯蟹呼肠孤病毒是双链RNA病毒，9-12个基因组片段，其序列已 测定并在GenBank上公布(登录号:KP638402-KP638413),目前该病毒的检测方法有电镜法、 RT-PCR检测法等，但在实际操作中这些方法都存在很多问题：一是操作过程比较繁琐，所需 要的仪器比较复杂，不利于大面积普查和现场检测；二是灵敏度不够高无法检测到潜伏病 毒样品。

发明内容

本发明的目的在于为了克服以上现有技术的不足而提供一种中华绒螯蟹呼肠孤 病毒的RT-LAMP检测用引物组以及检测试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供一种中华绒螯蟹呼肠孤病毒的RT-LAMP检测方法。

本发明的技术方案如下：

一种用于检测中华绒螯蟹呼肠孤病毒的RT-LAMP扩增引物组，该引物组包括以下 引物：

引物EsRV-FIP:

CAAGAACCCACTTCGGAGCGT-GCTGCACCTGTAGTACTTGG；

引物EsRV-BIP:

TGCGACTATCGAAGGCGTGC-GATAGCCCTGGATAAGCCAC；

引物EsRV-F3:TGCTGTTCTACACTTTGCGC；

引物EsRV-B3:CGTCGTGCCTTTTAGGTCC。

一种中华绒螯蟹呼肠孤病毒RT-LAMP检测试剂盒，包括以上所述的RT-LAMP扩增引 物组。

所述的中华绒螯蟹呼肠孤病毒RT-LAMP检测试剂盒，该试剂盒还可以包括病毒RNA 提取试剂，RT-LAMP扩增反应液，BstDNA聚合酶、AMV逆转录酶，阴性对照和阳性对照。

所述的中华绒螯蟹呼肠孤病毒RT-LAMP检测试剂盒，所述病毒RNA提取试剂包括 Trizol、氯仿、异丙醇、无RNase的75％的无水乙醇和DEPC水。

所述RT-LAMP扩增反应液为：10×Thermopolbuffer、150mM硫酸镁、10mMdNTP、5M 甜菜碱水溶液按体积8∶4∶5∶8混合后的混合液。

所述阴性对照为无核酸的RNasefreewater；阳性对照为含有中华绒螯蟹呼肠孤 病毒基因组RNA。

以上所述的中华绒螯蟹呼肠孤病毒RT-LAMP检测试剂盒，还可以包括RT-LAMP显色 液，该显色液具体为7.5mMMnCl₂和625μM钙黄绿素水溶液按体积1∶1混合后的混合液。

一种所述的中华绒螯蟹呼肠孤病毒RT-LAMP检测试剂盒的检测方法，不包含RT- LAMP显色液时检测方法包括以下步骤：

(1)待检样品RNA提取：取30-50mg中华绒螯蟹肌肉组织匀浆，用病毒RNA提取试剂 抽提中华绒螯蟹总RNA，置于-20℃保存备用；

(2)RT-LAMP扩增反应：25μl反应体系包括：1.6μmol/LEsRV-FIP和EsRV-BIP，0.2μ mol/LEsRV-F3和EsRV-B3，RT-LAMP反应液12.5μl，5UAMV逆转录酶，8UBstDNA聚合酶，待 检样品RNA2μl，不足部分用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照，配制好的反应 管混匀后离心，在恒温水浴锅上63-65℃反应30-60min；

(3)RT-LAMP反应产物检测：浊度检测，反应完成后，扩增产物有焦磷酸镁生成，反 应管呈现浑浊则为阳性，否则为阴性；凝胶电泳检测，反应完成后，取5μl扩增产物凝胶电 泳，电泳图像有阶梯型条带的为阳性，否则为阴性。