[发明专利]一种口腔支原体的活体冻干体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种将菌种活性冻干的方法，具体是指用于将口腔支原体活体菌液制备成活体冻干体的一种口腔支原体的活体冻干体的制备方法。

背景技术

生物制剂企业需要培育和长期库存保藏大量的生物菌种活体用于生物制剂的生产，对于库存保藏口腔支原体活体，现有技术通常采用斜面低温保藏法、液体石蜡保藏法、滤纸保藏法、沙土保藏法和液氮冷冻保藏法等；上述库存保藏方法各有利弊，其中，斜面低温保藏法，可保存2-4个月，且需每月移种一次，存在保存时间短、菌种易于变异的弊端；液体石蜡保藏法，可保存1-2年，但保存时须将试管直立放置，占用空间大，不便于携带和批量运输；滤纸保藏法可保藏2年，沙土保藏法可保存2年，该两种方法由于营养细胞效果不良，菌种活体存活率低；液氮冷冻保藏法保存期限长，但需借助特殊设备，依赖液氮源，长期保藏的维护保障复杂，成本高；因此，现有技术存在保藏时间短、易于变异、存活率低、成本高、不便于大量保存和运输的问题与不足。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题与不足，本发明采用在真空及低温的作用下使水分不经固化直接升华的冻干方法，将口腔支原体活体菌液脱水制成口腔支原体活体冻干体；利用活体冻干体能够在相对较高温度(-20℃)下长期保存、复原性好、不变异、保藏成本低、占用空间小、便于量产库存和运输特性的技术方案，提供一种口腔支原体的活体冻干体的制备方法，旨在使口腔支原体活体的库藏，达到保存期限长，不变异、存活率高、成本低，便于大量保存和运输的目的。

本发明的目的是这样实现的：一种口腔支原体的活体冻干体的制备方法，包括原料和制备工艺，其中：

所述的原料为：

菌株：口腔支原体(ATCC23714株)

A培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基，试剂BR级；

细胞培养剂：灭活新生牛血清，药用级生物制品；

保护剂：脱脂牛奶，10％脱脂牛奶浓度，药用级生物制品；

C溶剂：蒸馏水；

D溶剂：注射用水，药用级；

E溶剂：生理盐水，药用级；

所述的制备工艺包括，菌液制备工艺和活体冻干工艺，其中，

所述菌液制备工艺为：

按A培养基1.0～2.0g，C溶剂50ml的比例，在三角瓶中对A培养基与C溶剂进行摇匀并40～50℃加热溶解，之后用50ml规格的试管分装成30ml/管，经高压灭菌121℃，15分钟处理，之后静置冷却至低于55℃，获得A基单管；

按保护剂8～12g，D溶剂100ml的比例，在三角瓶中对保护剂与D溶剂进行摇匀混合，经高压灭菌115℃，15分钟处理，之后静置冷却至室温，获得稀保剂；

在所述A基单管中加入细胞培养剂6～8ml，轻轻摇匀，勿使产生气泡，之后倾斜30°架置，静置凝结，制成斜面基，凝结后获得新生牛血清胰酪大豆胨琼脂斜面培养基的单管，简称血琼基斜单管，待用；

按1∶1的比例用E溶剂将菌株复溶稀释，混合均匀后，用无菌吸管取出，均匀涂抹接种至所述血琼基斜单管的血琼基的表面上，之后，静置36℃±1℃中培养2～4天，届时所述血琼基的表面上生长出一层菌苔，用刮刀轻轻刮取所述菌苔，一只所述血琼基斜单管收获的所述菌苔量称为单管量，按单管量配比所述稀保剂20ml的比例，将所述菌苔移至三角瓶中与所述稀保剂进行混匀，获得高浓度的活体菌液；

将所述活体菌液按0.3ml/管分装至冻干管中，管顶封以无菌棉花，防止微生物污染，获得菌液冻干管，待用；

所述的活体冻干工艺，包括入柜、预冻、冷阱制冷、抽真空、第一阶段升温干燥、过渡升温阶段、第二阶段解析干燥、冻干结束和熔封保存，其中：

步骤一、入柜

将一只仅装有所述保护剂的冻干管作为温度测定管；

将所述菌液冻干管排列装入冻干机的柜中，将所述温度测定管插列在其间，将冻干机的温度探头插入所述温度测定管内且浸没在所述保护剂中，所述菌液冻干管、所述温度测定管的底部均须与冻干机的搁板接触，设置冻干机的搁板温度为-30℃～-40℃，之后关闭柜门、开机，冻干机进行干箱制冷；

步骤二、预冻

当温度测定管内的温度降至-40℃时开始预冻计时，预冻用时为3小时；

步骤三、冷阱制冷

预冻结束后，将冻干机由干箱制冷切换至冷阱制冷；

步骤四、抽真空

冷阱温度≤-52℃之后，冻干机开启抽真空；

步骤五、第一阶段升温干燥