[发明专利]一种高肌肉量及肥厚型心肌病模型克隆猪的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种利用CRISPR/Cas9系统及双Cas9n技术进行的Trim63基因的修饰。

背景技术

肌肉由肌纤维组成，动物在出生后肌纤维的数量基本保持不变，因此肌肉大小主要取决于肌纤维的大小。而肌纤维的大小取决于肌纤维细胞内蛋白质的合成与降解的平衡：当蛋白质合成大于降解时，肌纤维表现为肥大，反之当蛋白质降解大于合成时，肌纤维则表现为萎缩。

作为肌肉特异表达的E3泛素连接酶，三结构域蛋白63(tripartitemotif-containing63，Trim63)和F-box蛋白32(F-boxprotein32，Fbxo32)调控了绝大多数肌浆蛋白和肌肉生长调控因子的降解。Trim63和Fbxo32于2001年被发现在几乎所有的肌肉萎缩的模型中都明显上调，并且在人和大鼠中都只在骨骼肌和心脏中表达。在Trim63和Fbxo32敲除后，小鼠都表现出显著的抗肌肉萎缩的能力，并且在生长和繁殖方面表现完全正常。但是对于敲除TRIM63后肌肉量变化并无系统研究。

有研究表明，小鼠双等位基因敲除Trim63和Trim55之后，能够表现自发的心肌病。但是当小鼠的四个等位基因中的一个尚未缺失时(Trim63^-/-//trim55^+/-或Trim63^+/-，Trim55^-/-)，敲除鼠与野生鼠无异(WillisMSetal.Muscleringfinger1andmuscleringfinger2arenecessarybutfunctionallyredundantduringdevelopmentalcardiacgrowthandregulateE2F1-mediatedgeneexpressioninvivo.CellBiochemFunct.2014Jan；32(1):39-50.doi:10.1002/cbf.2969.Epub2013Mar20.)。而单独缺失Trim63双等位基因的小鼠，需经过主动脉缩窄术才能诱导出心肌肥大的症状，若未经手术，则无法出现Trim63^-/-鼠的病理表型(WillisMS，IkeC，LiL，etal.Muscleringfinger1，butnotmuscleringfinger2，regulatescardiachypertrophyinvivo.CircRes.2007；100:456–9.)。这与人类发生肥厚型心肌病的机理有极大的不同。

而对于猪等大动物，目前尚未有Trim63基因对于肌肉量的维持以及肥厚型心肌病的功能方面的研究。

猪作为主要家畜之一，由于存在肉类市场方面的需求，需要制备高肌肉量克隆猪。而猪的心脏结构与人类几乎一模一样，是人类心血管研究中最重要的一种模式生物，构建肥厚型心肌病疾病模型有助于人类加深对该类疾病的认识，从而提供更多更好的治疗方案。因此，亟需一种能够获得该模型克隆猪的方法。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供Trim63基因在制备高肌肉量及肥厚型心肌病模型克隆猪中的应用以及一种高肌肉量及肥厚型心肌病表型的克隆猪的制备方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供Trim63基因在制备高肌肉量及肥厚型心肌病模型克隆猪中的应用。

所述应用为将修饰猪Trim63基因的体细胞作为核移植供体细胞，卵母细胞为核移植受体细胞，通过体细胞核移植技术获得克隆胚胎；将克隆胚胎移入猪子宫内妊娠即可获得Trim63基因修饰后的高肌肉量及肥厚型心肌病模型克隆猪，无需再对克隆猪进行主动脉缩窄术等人工干预手段。

第二方面，本发明提供一种高肌肉量及肥厚型心肌病表型的克隆猪的制备方法，所述方法包括如下步骤：

1)根据特异性靶向Trim63基因第一外显子的sgRNA，构建针对Trim63基因第一外显子靶点的打靶载体；所述猪Trim63基因第1外显子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述sgRNA的DNA序列如SEQIDNO.2和/或SEQIDNO.3所示；

2)将所述打靶载体转入猪成纤维细胞，获得阳性细胞克隆；以阳性细胞为核移植供体细胞，卵母细胞为核移植受体细胞，通过体细胞核移植技术获得克隆胚胎；将克隆胚胎移入猪子宫内妊娠获得Trim63基因修饰后的高肌肉量及肥厚型心肌病模型克隆猪。