[发明专利]拟海桑提取物的生物活性MTT测定方法

说明书

技术领域

本发明属于海洋生物医药技术领域，具体涉及一种拟海桑提取物的生物活性MTT测定方法。

背景技术

拟海桑(Sonneratiapara caseolaris)属于海桑科海桑属，为我国稀有濒危红树植物，仅天然分布于海南岛，分布范围狭窄，个体数量稀少。正处于濒危状态，被列入《中国生物多样性国情研究报告》中国被子植物濒危及稀有种名录。在前期的生物活性筛选实验中，拟海桑的甲醇提取物对小鼠白血病肿瘤细胞株P-388和人肝癌细胞株BEL-7402显示较强的细胞毒活性。因此，本项目选择拟海桑进行细致的化学成分研究，期望发现海洋来源活性先导化合物。

拟海桑化学成分的研究只有一篇报道，2012年郭跃伟课题组对采自广东湛江的拟海桑进行化学成分研究，从中分离得到一个新骨架化合物ParacaseolideA(69)是一个二聚-烷基丁内酯类化合物内酯甲素，体外药理活性筛选显示该化合物对细胞周期分裂蛋白25B具有显著的抑制活性。

发明内容

本发明旨在为拟海桑的提取物提供一种方便可靠的生物活性测定方法。

一种拟海桑提取物的生物活性MTT测定方法，包括如下步骤：

(1)取对数期肿瘤细胞，调整细胞悬液的浓度为200000个/mL，每孔200μL，加入96孔细胞培养板中；

(2)在培养箱中培养4h(37ºC，5%CO₂)；

(3)待测样品分别设5个浓度梯度(每个浓度3个平行样)，同时设阴性、阳性对照，每孔加空白液或样品液2μL，培养72h；

(4)每孔加入MTT液10μL，继续培养4h；

(5)终止培养，离心8min(37ºC、2000r/min)，吸去孔内培养液；

(6)每孔加入DMSO各100μL，于微量振荡器中振荡15min，直至结晶充分溶解；

(7)酶标仪测定每孔在570nm处的吸光值(即OD值)。取三孔的平均OD值，按公式IR%=(OD_空白对照-OD_样品)/OD_空白对照×100%计算样品对细胞增殖的抑制率(IR%)。

测定原理为：MTT为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，是一种黄颜色的染料，其检测原理为在活细胞线粒体中，琥珀酸脱氢酶可以使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。Formazan与活细胞数成正比，二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。以此原理来测定化合物的抗肿瘤活性。

本发明的测定方法相对于现有技术简单快速、而且检测结果可靠，适于推广应用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

选择HL-60、P388和K562细胞株用MTT法对从拟海桑分离得到的木质素类化合物(SP-29~SP-32)进行细胞毒活性的评价，包括如下步骤：

(1)取对数期肿瘤细胞，调整细胞悬液的浓度为200000个/mL，每孔200μL，加入96孔细胞培养板中；

(2)在培养箱中培养4h(37ºC，5%CO₂)；

(3)待测样品分别设5个浓度梯度(每个浓度3个平行样)，同时设阴性、阳性对照，每孔加空白液或样品液2μL，培养72h；

(4)每孔加入MTT液10μL，继续培养4h；

(5)终止培养，离心8min(37ºC、2000r/min)，吸去孔内培养液；

(6)每孔加入DMSO各100μL，于微量振荡器中振荡15min，直至结晶充分溶解；

(7)酶标仪测定每孔在570nm处的吸光值(即OD值)。取三孔的平均OD值，按公式IR%=(OD_空白对照-OD_样品)/OD_空白对照×100%计算样品对细胞增殖的抑制率(IR%)。

测定结果见表，分析表中数据可以看出在浓度为50μM浓度水平，化合物SP-29和SP-31对3种肿瘤细胞株都具有中等以上的抑制活性，SP-30对K562细胞株有中等强度的细胞毒活性，SP-32对这3种细胞株的活性均较弱。