[发明专利]液相色谱串联质谱法同时检测牛奶中多种非蛋白含氮化合物含量的方法

权利要求书

1.液相色谱串联质谱法同时检测牛奶中多种非蛋白含氮化合物含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)向待测样品中加入蛋白沉淀剂，涡旋，离心，取上清液；

(2)向所述上清液中加入除脂剂，涡旋，离心，弃除脂剂层，将下清液浓缩后用氨水乙腈溶解、涡旋，得待净化液；

(3)将所述待净化液过HLB固相萃取柱，收集洗脱液并将其浓缩后用体积比为1:9的0.15％甲酸水溶液-乙腈混合液溶解、定容，微孔滤膜过滤，得待测液；

所述0.15％甲酸水溶液中含有3～10mM乙酸铵；

(4)配制含有地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺中至少四种非蛋白含氮化合物的标准混合溶液，将标准混合溶液进行梯度稀释，获得标准混合工作溶液系列；

(5)将所述标准混合工作溶液系列和所述待测液在预设的液相色谱串联质谱条件下分别进样，根据标准混合工作溶液系列的检测结果制作标准曲线，再根据标准曲线和待测液的检测结果计算待测液中相应非蛋白含氮化合物的含量；

其中，液相色谱条件为：

色谱柱：Waters XBridge HILIC，4.6mm×150mm，3.5μm；

流动相A：0.15％甲酸水溶液，含3～10mM乙酸铵；

流动相B：乙腈；

流速：0.4mL/min；

进样量：10μL；

柱温：40℃；

梯度洗脱程序：①0min：10％A，90％B；

②3.0min：50％A，50％B；

③8.0min：50％A，50％B；

④9.0min：10％A，90％B；

⑤20.0min：10％A，90％B；

质谱条件为：

离子源：电喷雾离子源；

扫描方式：正离子扫描；

监测方式：多反应监测；

电喷雾电压：3500V；

离子源温度：250℃；

干燥气温度：高纯氮气，250℃；

干燥气流量：高纯氮气，16L/min；

雾化气压力：高纯氮气，275.8kPa；

鞘气温度：高纯氮气，350℃；

鞘气流量：高纯氮气，10L/min；

质谱参数为：

⑥地昔尼尔：定量离子对为191.1/150.0，碰撞能量为21V；定性离子对为191.1/109.1，碰撞能量为31V；

⑦双氰胺：定量离子对为85.1/68.1，碰撞能量为20V；定性离子对为85.1/43.1，碰撞能量为22V；

⑧缩二脲：定量离子对为104.2/61.0，碰撞能量为9V；定性离子对为104.2/44.1，碰撞能量为37V；

⑨环丙氨嗪：定量离子对为167.2/85.1，碰撞能量为20V；定性离子对为167.2/125.1，碰撞能量为18V；

⑩三聚氰胺：定量离子对为127.1/85.1，碰撞能量为19V；定性离子对为127.1/68.1，碰撞能量为36V。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，先向所述待测样品中添加三聚氰胺-¹⁵N₃内标物，再添加蛋白沉淀剂。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述三聚氰胺-¹⁵N₃内标物的添加量为50～200ng。

4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述三聚氰胺-¹⁵N₃内标物的质谱参数为：离子对为130.2/87.1，碰撞能量为19V。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述蛋白沉淀剂为乙腈。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，乙腈与待测样品的混合体积比为(15～20)：1。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述除脂剂为正己烷。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，正己烷与所述上清液的混合体积比为(1～1.5)：2。

9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，将所述下清液浓缩后用3～10％氨水乙腈溶解。

10.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述0.15％甲酸水溶液中乙酸铵的浓度为5mM。