[发明专利]一种解链式水解探针实时荧光PCR

权利要求书

1.所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征是借鉴MolecularBeacon首尾自身结合的一种两两相互结合并随扩增产物解链的TaqMan荧光探针及PCR技术；其关键是探针5’端荧光基团标记的常规碱基序列仍能被Taq酶的外切酶活性水解产生荧光，3’端靶序列外添加5～8个与5’端3～14个碱基之后的中部序列反向互补的人为碱基再标记淬灭荧光基团的新性能探针实时荧光PCR检测技术，以减少实时荧光定量PCR的本底非特异性。

2.根据权利要求1所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征在于，所述的解链式探针是指模板序列探针5′末端标记荧光素且在PCR中可被DNA聚合酶外切酶活性水解；3’端靶结合序列外添加5～8个与5’端4～10个碱基之后的中部序列反向互补的人为碱基再标记淬灭荧光基团，由于环状结合部分较短杂交使自身较难形成锅柄样结构，但两探针两段结合力大而很容易互补结合，这样不仅加强抑制本底荧光，也规避了探针与过量引物间形成非特异性杂交延伸的聚合体，兼容了Molecularbeacon本底低和TaqMan灵敏、特异的优点。

3.根据权利要求1所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征在于，所述的荧光探针设计策略原则是：首先选取一段小于40nt的靶荧光探针序列并遵守一般常规荧光探针设计所有原则，再在其3′末端多加5-8个与5’端4～10个碱基之后的中部序列反向互补的人为碱基，且在最末端标记淬灭剂TAMRA(6-羧基-四甲基-罗丹明rhodamine)、DABCYL或BHQ1等，则探针5′端可选择标记荧光素FAM、HEX或TET。

4.根据权利要求1所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征在于，所述的实验条件同于一般常规TaqMan探针实时荧光PCR反应体系；为了更进一步增加扩增特异性和减少循环前低温非特异性反应，联合采用各种热启动DNA聚合酶，化学修饰耐热聚合酶或加热缓释Mg²⁺缓冲液等各种PCR优化方法，将更加极大地完善本发明一种解链式水解探针实时荧光PCR质量。

5.根据权利要求1所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征在于，所述的引物采用中部5-8个碱基同序的引物对以减少引物二聚体PD程度，从而减少对靶扩增的竞争性抑制，提高灵敏度。

6.根据权利要求1所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征在于，所述的PCR反应液加等体积的矿物油单独使用，封闭反应液，不联用热盖条件。

7.根据权利要求1所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征在于，所述的技术用于基因检测试剂盒，盒成份包括：核酸提取试剂，5mMdNTPs，TaqDNA聚合酶及其缓冲液，荧光探针，上游引物F/下游引物R，标准对照物，纯化水dH₂O，矿物油。