[发明专利]一种用于平行测定尿嘧啶-DNA糖基化酶和内切酶IV活性的方法及其应用和试剂盒

说明书

本发明提供了一种用于平行测定尿嘧啶‑DNA糖基化酶和内切酶IV活性的方法及其应用和试剂盒。当目标物为UDG时，若UDG存在，所述发夹探针中的U碱基被移除，产生一个AP位点，产生的AP位点被工具酶EndoIV切刻，释放出含自由3’末端的引物序列用于引发随后的滚环放大反应RCA；若UDG不存在时，3’末端被封闭在所述发夹探针，RCA过程不能进行；当目标物为EndoIV时，若EndoIV存在，其RCA过程与上述UDG活性检测中的RCA过程是一样的，若EndoIV不存在时，3’末端被封闭在所述发夹探针，RCA过程不能进行。其既能用作UDG的识别探针又能用作EndoIV的前体识别探针，因此简化了探针的设计。UDG和EndoIV的检测限分别低至0.00017U/mL和0.11U/mL，结果比其他免标记荧光方法更好或相当。

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种用于平行测定尿嘧啶-DNA糖基化酶和内切酶IV活性的方法及其应用和试剂盒。

背景技术

尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)和内切酶IV(EndoIV)都是U碱基移除修复(UBER)酶，它们在保持基因组的完整性上具有重要作用。UDG和EndoIV能在修复DNA中的U碱基损伤时发挥协同功能，具体来讲，UDG移除U碱基损伤并产生无碱基(AP)位点，随后EndoIV切刻该AP位点。UBER酶的活性异常将抑制细胞对U碱基损伤的响应，这将导致各种相关疾病，包括免疫缺综合症，淋巴瘤，和布鲁姆综合症。研究表明，UBER酶的活性已成为上述疾病的一种有前途的生物标志物，并且对UBER酶的活性检测方法代表一种候选工具用于临床诊断及其功能研究。

UBER酶活性的常用检测方法，包括凝胶电泳法，电化学法和比色法，分别受到放射性危害，复杂的电极修饰过程，或有限灵敏度的局限。作为另一种选择，荧光法因其安全和灵敏的特点而吸引了人们的广泛关注。为得到明显的荧光信号，已发展了许多基于标记的荧光策略用于UBER酶的活性检测，得到了令人满意的结果。然而，这些基于标记的荧光策略需要将荧光团或猝灭团共价捕获到DNA上，导致传感系统的生物相容性降低并对UBER酶的活性造成不利影响。为解决这个问题，一些免标记的荧光策略已被报道用于UBER酶的活性检测。含U碱基的DNA探针在UDG引发下能形成G-四倍体(G4)，这种探针已被设计用于UDG活性检测，并且当G4与金属复合物或N-甲基-卟啉IX(NMM)绑定时产生免标记的荧光信号。另外，Ma课题组提出了一种利用G4-选择性的金属复合物的免标记荧光策略实现了对EndoIV的活性检测。尽管上述免标荧光策略已实现了对UDG或EndoIV的活性检测，但是需设计不同的传感探针以实现对UDG和EndoIV的活性检测，这增加了探针设计的复杂性。因此，仍需发展一种基于同一探针的新型免标荧光策略用于平行检测UDG和EndoIV的活性。

发明内容