[发明专利]一种过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌及其构建方法和应用有效
| 申请号： | 201510961716.2 | 申请日： | 2015-12-17 |
| 公开（公告）号： | CN105420265B | 公开（公告）日： | 2020-01-07 |
| 发明（设计）人： | 朱娅媛;李炜炤;王敏;郑宇;申雁冰;宋佳 | 申请（专利权）人： | 天地壹号饮料股份有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/74 | 分类号： | C12N15/74;C12N1/21;C12P7/54;C12J1/04;C12R1/02;C12R1/01 |
| 代理公司： | 44288 广州市越秀区哲力专利商标事务所(普通合伙) | 代理人： | 唐超文;贺红星 |
| 地址： | 529000 广东*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 过量 表达 atp 基因工程 醋酸 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌在醋酸发酵中应用，所述醋酸发酵以乙醇或含有乙醇的酒醪为原料，其特征在于，该过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌由以下步骤构建而得：
a．将乙醛脱氢酶启动子、ATP酶基因以及可在醋酸菌中稳定复制的质粒依次连接，得到重组质粒；所述乙醛脱氢酶启动子来源于巴氏醋杆菌；可在醋酸菌中稳定复制的质粒为pBBRR1MCS-4质粒；重组质粒为pBBR-paldh-ATPase质粒；所述乙醛脱氢酶启动子序列如序列SEQ ID No:1所示；b．将经过a步骤得到的重组质粒转入醋酸菌中，即得。
2.根据权利要求1所述的过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌在醋酸发酵中应用，其特征在于，所述a步骤具体包括如下步骤：
Ι.以巴氏醋杆菌基因组为模板，进行PCR反应，得到乙醛脱氢酶启动子序列，所述乙醛脱氢酶启动子序列如序列SEQ ID No:1所示；
其中PCR反应所用到的引物对为：
paldh-1：5'- CGC
paldh-2：5'-AGC
PCR反应的条件为：94-95 ℃预变性5 分钟，94-95 ℃ 30秒s，50-60 ℃ 20秒，72 ℃20-40秒，25-30个循环后72℃ 10 分钟；
Ⅱ.将质粒pBBR1MCS-4和步骤Ι得到的SEQ ID No:1序列分别用限制性内切酶BamH I和Spe I处理，处理时间为2-12h、环境温度为37 ℃；纯化回收，将酶切纯化后的质粒和SEQ IDNo:1序列按摩尔比1:0.2-5混合，然后利用T4 DNA连接酶进行连接反应，反应温度为14-16℃，反应时间为4-12小时；接着将连接产物转入大肠杆菌DH 5α感受态中，获得重组质粒pBBR-Paldh；
Ⅲ.以巴氏醋杆菌基因组为模板，进行PCR反应，得到ATP酶基因序列，所述ATP酶基因序列如序列SEQ ID No:2所示；
其中PCR反应所用到的引物对为：
ATPase-1：5'- AGC
ATPase-2：5'- TGC
PCR反应条件为：94-95℃预变性5分钟，94-95℃ 30秒，50-60℃ 20秒，72℃ 1-2分钟，25-30个循环后72℃ 10 分钟；
Ⅳ.将步骤Ⅱ得到的重组质粒pBBR-Paldh、步骤Ⅲ得到的ATP酶基因序列分别用限制性内切酶Spe I和Xba I处理，处理时间为2-12h、环境温度为37 ℃；纯化回收，将酶切纯化后的质粒和ATP酶基因序列按摩尔比1:0.2-5混合，然后利用T4 DNA连接酶进行连接反应，反应温度为14-16 ℃，反应时间为4-12小时；然后将连接产物转入大肠杆菌DH 5α感受态中，获得重组质粒pBBR-Paldh-ATPase。
3.根据权利要求1所述的过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌在醋酸发酵中应用，其特征在于，所述b步骤中采用电激转化法将a步骤得到的重组质粒转入醋酸菌中。
4.根据权利要求1所述的过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌在醋酸发酵中应用，具体包括如下步骤：将过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌在培养基中进行扩繁培养，然后将扩繁培养后的过量表达ATP酶的基因工程醋酸菌和原料一起置于发酵罐中，进行发酵。
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