[发明专利]一种萤火虫荧光素酶的编码基因及制备方法

权利要求书

1.一种高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因，其特征在于：所述高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因的序列为SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

2.一种荧光素酶重组表达载体，其特征在于：所述荧光素酶重组表达载体携带如权利要求1所述高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因。

3.一种荧光素酶重组基因工程菌，其特征在于：所述荧光素酶重组基因工程菌携带如权利要求1所述高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因。

4.一种权利要求3所述的荧光素酶重组基因工程菌的构建方法，其特征在于所述构建方法包括以下步骤：

⑴.采用化学全合成的方法合成高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因，同时在上、下游各引入一个酶切位点以及相应保护碱基；

⑵.将步骤⑴获得的带有上下游酶切位点与保护碱基的高效表达的高热稳定性荧光素酶编码基因构建到大肠杆菌表达载体中，获得荧光素酶重组表达载体；

⑶.用步骤⑵获得的重组表达载体转化大肠杆菌宿主菌，得到荧光素酶重组基因工程菌。

5.如权利要求4所述构建方法，其特征在于：所述的上游或下游酶切位点是AatII、AvaI、KpnI、NdeI、NcoI、NotI、EcoRV、SalI、SbfI、SacI、SacII、BamHI、BglII、EcoRI、PstI、XhoI、XbaI和HindIII中的任意一个；上游与下游酶切位点应当不同，且应当同时位于所选用的表达载体的多克隆位点区。

6.如权利要求4所述构建方法，其特征在于：所述的表达载体是pMAL-p5E、pMAL-p5X、pMAL-p4E、pMAL-p4X、pET-42a(+)、pET-39b(+)、pET-28a(+)中的任意一个。

7.一种利用权利要求3所述荧光素酶重组基因工程菌制备重组高热稳定性荧光素酶的方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

⑴.以权利要求3所述的荧光素酶重组基因工程菌作为生产菌株，挑取其单菌落至10mL灭菌种子培养基，37℃培养16h，获得种子液；

⑵.以1～5％(v/v)的接种量将步骤⑴获得的种子液接种于灭菌发酵培养基，37℃培养2～4h后，加入终浓度为0.1～0.4mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，25℃诱导培养20～36h；

⑶.将步骤⑵诱导培养后所得菌液于4℃,7500rpm离心30min收集菌体，用pH值7.0、浓度为0.1mM的磷酸钾缓冲液离心洗涤菌体2次，获得湿菌体；

⑷.用pH值7.0、浓度为0.1mM的磷酸钾缓冲液重悬步骤⑶所得湿菌体后，破碎重悬菌液，于4℃、12000rpm，离心30分钟，收集上清液，此上清液为粗酶液；

⑸.利用亲和层析柱纯化步骤⑷所得粗酶液，获得重组高热稳定性荧光素酶。

8.如权利要求7所述制备方法，其特征在于：所述的种子培养基配方为,每100mL含有：蛋白胨0.7g，酵母粉1g，氯化钠1g，20％甘油溶液5mL，余量为去离子水。

9.如权利要求7所述制备方法，其特征在于：所述的发酵培养基配方为，每1000mL含有：蛋白胨5～15g，酵母粉20～30g，20％甘油溶液20～50mL，20％葡萄糖溶液5～10mL，氯化钠2～3g，氯化铵2～3g，十二水合磷酸氢二钠24～36g，磷酸二氢钠2.2～6.3g，余量为去离子水。