[发明专利]一种猪胸膜肺炎放线杆菌外膜囊泡的制备方法及其疫苗

权利要求书

1.一种猪胸膜肺炎放线杆菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于,包括如下步骤：

a.体外培养猪胸膜肺炎放线杆菌至细菌对数期早期，在培养基中添加铁离子螯合剂二乙烯三胺五乙酸钙三钠盐水合物，形成铁离子限制环境后继续培养细菌，通过离心、过滤获取无细胞培养上清；

b.对无细胞培养上清进行超速离心处理，制得猪胸膜肺炎放线杆菌释放的外膜囊泡。

2.根据权利要求1所述一种猪胸膜肺炎放线杆菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，所述体外培养猪胸膜肺炎放线杆菌方法为：

将shope菌株的冻干菌种划线接种于含NAD的THB固体培养基，5％～10％CO₂条件下，37℃培养16h～18h，接种固体培养基上5～8个单菌落至6mL含NAD的THB液体培养基，37℃振荡培养6h～8h；含NAD的THB固体培养基为：每1000mLTHB加入15g琼脂粉，121℃高压灭菌15分钟，待培养基温度至50℃时，添加NAD至0.01％(v/w)，适量倾入平皿中凝固；含NAD的THB液体培养基为：称取30g THB，溶解于1000mL去离子水，121℃高压灭菌15分钟，待培养基恢复至室温，添加NAD至0.01％(v/w)；

随后将细菌培养物以体积比1％比例接种400mL含NAD的THB液体培养基，继续37℃振荡培养，待细菌培养至对数生长早期OD600nm为0.1～0.2时，在培养基中添加终浓度150μM二乙烯三胺五乙酸钙三钠盐水合物，形成铁离子限制环境，继续37℃振荡培养14h～16h。

3.根据权利要求1或2所述的一种猪胸膜肺炎放线杆菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，

所述细菌外膜囊泡的制备方法为：

收集体外培养猪胸膜肺炎放线杆菌培养物，4℃10000g离心15min，弃去沉淀，0.22μm过滤上清，获得无细胞上清物；4℃150000g超速离心3h，弃去上清，沉淀以适量PBS缓冲液重悬；PBS缓冲液为：8mMNa₂HPO₄·12H₂O、1.5mM KH2PO4、2.7mM KCl、136.7mM NaCl，pH 7.4，121℃高压灭菌15分钟；

同上再次4℃150000g超速离心3h，弃去上清，沉淀重悬于3mL PBS缓冲液，即为制备的细菌外膜囊泡。