[发明专利]一种多病原及耐药基因检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，是一种可靠的快速PCR检测多个病原及耐药的试剂盒。

背景技术

在世界范围内，败血症是导致住院病人死亡最常见的原因之，不适当地抗生素治疗是致病人死亡的独立决定因素。快速的病原鉴定和恰当的抗生素使用是有效治疗的基石，因此，迫切需要优于目前技术的、优越的阳性和阴性预测值的快速诊断方法。PCR检测是快速、敏感地检测细菌和真菌感染以及耐药的方法之一，并在准确性和灵敏度以及速度方面明显优于金标准全血培养方法。

全血中特异检测导致败血症的生物仍然在临床应用方面不能使人满意。目前，对怀疑有系统感染的病人，血液培养是检测其病原的金标准。众所周知，血液培养有一些明显的缺陷，特别是一些在取样前已经过抗生素治疗的情况，存在病原获取量不足，以及出现不能培养的生物等情况。再者，血液培养时，自样品获取到出结果需要3-5天的时间，对需要立即采取有效治疗的病人来说时间太长。

核酸扩增检测可以实现快速的靶病原的鉴定，但由于反应体积极小，迄今为止，这个方法的使用并不理想。

以上背景技术内容的公开仅用于辅助理解本发明的发明构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日已经公开的情况下，上述背景技术不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。

发明内容

本发明的目的在于提出一种多病原及耐药基因检测方法，以解决上述现有技术存在的病源获取量不足、血液培养所需时间过长以及反应体积过小等的技术问题。

为此，本发明提出一种多病原及耐药基因检测方法，同时针对34种造成败血症的细菌、7种真菌和5种耐药基因的检测，其特征在于：首先配置PCR反应液，然后进行PCR扩增；所述PCR反应液包括引物、分子探针、DNA聚合酶、20×Buffer、和dNTP，所述PCR扩增包括高温变性、低温复性和72℃延伸；

所述34种造成败血症的细菌中革兰氏染色阳性包括产气荚膜梭菌、粪肠球菌、屎肠球菌、金黄葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌链球菌、牛链球菌、停乳链球菌、变异链球菌、肺炎链球菌、酿脓葡萄球菌和血链球菌，其相应的引物中的上游引物的序列分别如SEQIDNO.1～SEQIDNO.15所示，下游引物的序列分别如SEQIDNO.47～SEQIDNO.61所示，其分子探针的序列分别如SEQIDNO.93～SEQIDNO.107所示；革兰氏染色阴性包括鲍氏不动杆菌、脆弱类拟杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌、流感嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯氏菌、摩根氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、粘质沙雷菌、嗜麦芽窄食单胞菌、颊普雷沃菌、中间普氏菌和产黑色普雷沃菌，其相应的引物中的上游引物的序列分别如SEQIDNO.16～SEQIDNO.34所示，下游引物的序列分别如SEQIDNO.62～SEQIDNO.80所示，其分子探针的序列分别如SEQIDNO.108～SEQIDNO.126所示；

所述7种真菌分别为：烟曲霉、白色念珠菌、都柏林念珠菌、光滑念珠菌、克鲁斯氏念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌，其相应的引物中的上游引物的序列分别如SEQIDNO.35～SEQIDNO.41所示，下游引物的序列分别如SEQIDNO.81～SEQIDNO.87所示，其分子探针的序列分别如SEQIDNO.127～SEQIDNO.133所示；

所述5种耐药基因分别为：甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药mecA、肠球菌万古霉素耐药vanA、肠球菌万古霉素耐药vanB、大肠杆菌β-内酰胺酶blaSHV和大肠杆菌β-内酰胺酶blaCTX-M，其相应的引物中的上游引物的序列分别如SEQIDNO.42～SEQIDNO.46所示，下游引物的序列分别如SEQIDNO.88～SEQIDNO.92所示，其分子探针的序列分别如SEQIDNO.134～SEQIDNO.138所示。

优选地，所述检测方法还包括在PCR反应前对反应混合液进行预读荧光本底，在所述分子探针与PCR产物的结合反应完成后，再次进行反应后荧光数值的读取的步骤。