[发明专利]肠出血性大肠杆菌检测用的引物和探针组、试剂盒及PCR检测方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及食品安全领域的实时荧光PCR检测技术，尤其涉及肠出血性大肠杆菌检测用的引物和探针组、试剂盒及PCR检测方法。

【背景技术】

大肠杆菌(Escherichiacoli)是一种在人和温血动物肠道内常见的细菌，大多数大肠杆菌菌株无害。然而，有些大肠杆菌可引起食源性疾病，其中，大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原(O)、鞭毛抗原(H)和表面抗原(K)，根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为二百多个型，其中有些血清型有致病性，可引起腹泻，统称为致泻性大肠杆菌。

根据生物学特性的不同可将致泻性大肠杆菌分为5大类：肠致病性大肠杆菌、肠产毒素性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠粘附性大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌(EHEC)。肠出血性大肠杆菌曾在多个国家暴发流行，成为了全球性的公共卫生问题；肠出血性大肠杆菌感染主要导致腹泻，可引起严重的食源性疾病，它主要通过食用被污染的食品传染给人类，如生的或未煮熟的碎肉制品、生鲜奶和被污染的生蔬菜和芽苗菜。

肠出血性大肠杆菌产生的毒素能使vero细胞产生病变，故称vero毒素，亦称志贺样毒素(SLT)或志贺毒素(Stx)，肠出血性大肠杆菌产生的志贺毒素(Stx)分两型：Stx1和Stx2。肠出血性大肠杆菌致病机制可分为两个方面，即粘附和产毒。病菌进入宿主肠道，主要依靠质粒介导的粘附因子(菌毛)与盲肠、结肠、回肠的上皮细胞接合并破坏绒毛，这种损伤被称为粘附和脱落损伤(AE损伤)，肠出血性大肠杆菌中编码AE损伤的基因在染色体上组成LEE毒力岛，LEE可被分成数个明显的区域、包括多个基因，研究表明其中的肠上皮细胞纤毛清除素(eae)基因被普遍认为AE损伤与有关。

肠出血性大肠杆菌的传统检验方法与其它病原微生物的检测一样需要在微生物增殖、生化鉴定的基础上进行血清学鉴定，虽然可靠、但却很耗时、费力，需要4～7天才能完成，因此，在需要及时、快速评价食品中微生物的安全性时，通常不被采用。随着现代检测技术发展，出现了针对病原微生物的快速检测方法。

实时荧光PCR技术自1996年出现以来在众多现代检测技术中脱颖而出，成为检测领域中重要的一种快速检测手段。实时荧光PCR法的检测原理决定了它具有其它分子生物学技术无法比拟的优点：(1)、高效率，节约检验时间。扩增和检测的过程通常少于6小时，PCR方案最优化或使用加快热循环技术可使整个检测时间能缩短到2小时以内；(2)、灵敏度高，比培养方法灵敏度有了大幅度提高；(3)、特异性强，检验成本合理；(4)、操作简单快速，与普通PCR相比无须后处理和电泳检测；(5)、可进行准确的定量检测，实时荧光定量PCR技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现了精确定量；(6)、自动化程度高、无污染，技术易于学习、易于进行电脑化数据管理。

【发明内容】

本发明的第一发明目的是，提供一种利用实时荧光PCR检测技术、对肠出血性大肠杆菌的stx1、stx2和eae三个基因检测且对肠出血性大肠杆菌具有良好特异性的引物和探针组。

本发明的第二发明目的是，提供一种利用实时荧光PCR检测技术、对肠出血性大肠杆菌的stx1、stx2和eae三个基因进行实时检测的试剂盒。

本发明的第三发明目的是，提供一种利用实时荧光PCR检测技术，具有特异性强、灵敏度高、检测快速可靠、操作简便，对肠出血性大肠杆菌的stx1、stx2和eae三个基因进行实时检测的检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：

一种肠出血性大肠杆菌检测用的引物和探针组，对于肠出血性大肠杆菌中的stx1基因、stx2基因和eae基因，它是由下述引物和探针组成：

stx1上游引物：TGTCGCATAGTGGAACCTCAC；

stx1下游引物：TCCCCTCTGTATTTGCCGAAA；

stx1探针：FAM-CAGTCTGTGGCAAGAGCGATGT-BHQ1；

stx2上游引物：ATGGGTACTGTGCCTGTTACT；

stx2下游引物：GCCCTCGTATATCCACAGCAA；

stx2探针：Cy5-AACAGACACCGATGTGGTCCCC-BHQ3；

eae上游引物：TACTCAATGCAGTTCCGTT；

eae下游引物：ATCCTGCTTCTTGTACTCC；