[发明专利]滚环扩增产物为模板的铜纳米颗粒合成方法及其在电化学检测中的应用

说明书

本发明提供了滚环扩增产物为模板的铜纳米颗粒合成方法及其在电化学检测中的应用。选用前列腺特异抗原(PSA)为模型目标分子。引物‑纳米金‑适配体/PSA/PSA抗体夹心结构的构建引发了滚环扩增反应，从而生成成千上万的聚胸腺嘧啶重复序列，以作为合成铜纳米颗粒的模板；进一步对形成的铜纳米颗粒用硝酸进行溶解，并用电化学方法对溶解得到的铜离子进行检测，最终实现对目标物PSA含量的确定。得益于所设计的信号级联放大策略，本方法检测PSA的线性范围为0.05fg/mL‑500fg/mL，检测限为0.020±0.001fg/mL PSA。最终，我们通过检测临床血清样品中的PSA含量对本方法的可实用性进行了验证。本方法的超灵敏度、特异性、以及检测实际样品的能力使其在疾病诊断应用中展示了巨大潜力。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及滚环扩增产物为模板的铜纳米颗粒合成方法及其在电化学检测中的应用。

背景技术

基于目标分子和生物识别分子之间的特异性相互作用对疾病的生物标志物进行检测对临床诊断有重要意义。通常，通过光学方法和电化学方法可以实现将这种生物绑定作用转换为可测量的信号。其中，光学方法具有高灵敏度，然而，这种信号转换方式不仅需要高精度的昂贵的仪器，也涉及到复杂的数值算法来分析数据，因此限制了这种方法的广泛应用。而电化学装置也能把生物反应转换成可检测的电信号，而且为医疗诊断提供了一个简单、准确和便宜的平台，并且很有可能实现便携的，实时现场的检测。更重要的是，结合电化学信号读出方法与各种行之有效的信号放大策略，可以得到高灵敏度、高特异性、高效的亲和性电化学生物传感器用于检测疾病标志物。

为了提高电化学生物传感器检测的灵敏度，基于DNA扩增技术的信号放大策略引起了人们研究的兴趣，包括聚合酶链反应(PCR)，链替代扩增反应(SDA)，环介导等温扩增法(LAMP)，杂交连锁反应(HCR)和滚环扩增技术(RCA)。在这些DNA扩增技术中，RCA是一个简单而强大的等温酶促过程，短的DNA或RNA引物在环状DNA模板和独特的DNA和RNA聚合酶的协助下发生链延伸，形成单链的DNA或RNA长链。由于快速、高效和特异性好等优点，RCA在众多分析应用中被广泛用于信号放大，如核酸、小分子、蛋白质、和病变细胞的检测，检测的目标甚至可以在aM浓度级别。RCA产物包含成千上万的串联重复序列，它们和环形模板是互补的。把这些串联重复序列转换成可检测电信号的读出方法对于实现各种分析目的是至关重要的。最常见的读出RCA产物的方法是与连有指示剂的互补寡核苷酸短链进行杂交，指示剂有荧光团，纳米粒子，量子点，联吡啶钌和酶等。相比之下，这种杂交方法涉及冗杂和耗时的过程，而另一种利用DNA插入分子的方法表现出相当大的便捷性，已被广泛用于读取RCA产物，插入分子包括亚甲基蓝，荧光染料，N-甲基卟啉二丙酸IX，银纳米粒子等。