[发明专利]BSMV-VIGS重组载体及其在小麦产量性状基因研究中的应用

权利要求书

1.一种BSMV-VIGS重组载体，为含有目标基因片段、噬菌体f1ori、抑制因子laci、大肠杆菌E1因子ori、β-内酰胺酶基因bla、T₇启动子的病毒RNA，其特征在于：所述目标基因片段为SEQIDNO.1所示的TaRSR1转录因子mRNA部分cDNA序列。

2.权利要求1所述BSMV-VIGS重组载体的制备方法，包括以下步骤：

（1）TaRSR1转录因子mRNA部分cDNA片段的克隆

提取小麦籽粒的总RNA，并通过反转录获得与小麦总RNA对应的cDNA，取所得cDNA作为模板，通过PCR扩增TaRSR1转录因子片段序列，将回收所得扩增产物连接至pMD18-Tsimple载体，再转化大肠杆菌DH5α，然后，挑取验证过的阳性单克隆，进行测序鉴定；

（2）BSMV-γ:TaRSR1重组载体的构建、转化

取测序正确的TaRSR1-pMD18-Tsimple质粒与BSMV-γ:GFP质粒分别用限制性内切酶NheI单酶切，再进行电泳检测、切胶回收，分别得到纯化的TaRSR1基因片段和BSMV-γ质粒；

用T₄-DNA连接酶将纯化后的TaRSR1基因片段连接至纯化后的BSMV-γ质粒，得到BSMV-γ:TaRSR1重组载体，再将其转化至感受态大肠杆菌JM109，涂布在LB平板培养基上，LB平板培养基经37℃过夜培养长出单菌落，将所得单菌落依次进行PCR验证、重组质粒酶切验证和测序鉴定，挑选阳性菌落，得BSMV-γ:TaRSR1重组载体。

3.一种病毒接种混合液，含等体积的BSMV-α、BSMV-β、权利要求2所述BSMV-γ:TaRSR1重组载体。

4.根据权利要求3所述病毒接种混合液，其特征在于：所述病毒接种混合液中各载体的浓度均为500μg/ml。

5.权利要求3所述病毒接种混合液的制备方法，包括以下步骤：

（1）BSMV载体线性化

用限制性内切酶MluI分别单酶切BSMV-α质粒和权利要求2所得BSMV-γ:TaRSR1重组质粒，使其线性化；用限制性内切酶SpeI单酶切BSMV-β质粒，使其线性化；

（2）体外转录生产病毒

取所得线性化BSMV-α、BSMV-β和BSMV-γ:TaRSR1载体DNA分别进行体外转录、检测和保存；

（3）病毒接种混合液的制备

取等体积的BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ:TaRSR1，与9倍于BSMV-α体积的DEPCwater和12倍于BSMV-α体积的2×GKPbuffer混合均匀，即成。

6.一种研究小麦产量性状基因功能的方法，包括以下步骤：

（1）于小麦抽穗期，在田间创造一个高湿、弱光、低温的环境，用权利要求3所述病毒接种混合液摩擦小麦穗部进行接种；

（2）接种后，于小麦开花期和灌浆期保持高湿环境；同时，接种7天后对接种植株进行表型观察、目标基因的转录水平检测，成熟时进行产量性状测定。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述高湿环境为湿度不小于85%；所述弱光环境为4月下旬下午黄昏时分18～19点；所述低温环境为18～22℃。

8.权利要求1所述BSMV-VIGS重组载体在小麦增产或育种中的应用。