[发明专利]一种生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法

权利要求书

1.一种生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法，其特征在于：通过培养基从烟草表面分离甾醇降解菌，利用种子培养基扩大培养该微生物，搜集对数期细胞，接种于烟草浸提液，发酵。

2.如权利要求1所述的生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法，其特征在于，它的步骤如下：

(1)降甾醇微生物的分离：用无菌水洗涤烟叶表面2-3次，收集沉淀，将沉淀用15mlpH7.0的磷酸缓冲液稀释后，按照10％接种量接种到分离培养基中，37℃摇床中，150r/min培养，于富集培养基中富集培养3次后，取200μl培养液涂于固体平板上，培养48h后获得可降解甾醇的微生物单菌落；

(2)微生物扩大培养：挑取步骤(1)中的单菌落到种子培养基中，于37℃摇床中，150r/min培养48小时，获得种子培养液，保存于4℃，同时取0.5ml菌液加0.5ml的50％甘油混匀后保存于-20℃；

(3)以步骤(2)中的种子培养液为种子，重新取1ml接种到50ml新鲜的种子培养液中，相同条件下培养48小时，每隔5小时取2ml菌液，测定OD值，在18-52h收集细胞，分别在6000转，4℃下离心30min，去掉上清液；

(4)甾醇降解条件：收集18-52h的细胞，并以质量1：50的比例将干细胞加入到烟草浸提液中，置于37℃的摇床中，150r/min下发酵2-8h。

3.如权利要求1所述的生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法，其特征在于：所述步骤(1)中分离培养基的组分：以分离培养基总量1L计，豆甾醇2.0±0.1g；葡萄糖2.0±0.1g；失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚1±0.1ml；柠檬酸2.0±0.1g；K₂HPO₄0.5±0.01g；NH₄Cl1.0±0.1g；余量为水。

4.如权利要求1所述的生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法，其特征在于：所述步骤(1)中富集培养基的组分：以富集培养基总量1L计，豆甾醇，5.0±0.1g；tween80，1±0.1ml；柠檬酸，2.0±0.1g；柠檬酸铁胺，0.05±0.01g；K₂HPO₄，0.5±0.1g；NH₄Cl，1.0±0.1g；余量为水。

5.如权利要求1所述的生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的种子培养液的组分：以种子培养液总量1L计，K₂HPO₄，0.5±0.01g；NH₄NO₃，2.0±0.1g；柠檬酸，2.0±0.1g；甘油，10.0±0.2g；余量为水，pH＝7.0-7.2。