[发明专利]光子重组的非线性超分辨显微方法及装置

说明书

技术领域

本发明属于共聚焦显微领域，特别涉及一种光子重组的非线性超分辨 显微方法及装置。

背景技术

一直以来，传统的远场荧光显微技术由于衍射极限的存在，因此在纳 米技术、材料、生物以及医学领域等的应用受到很大的限制。为了解决这 一问题，自从上个世纪90年代开始，人们提出了很多超分辨显微方法。在 这些所提出的方法中，荧光差分显微技术(FED)成为新近提出的方法中 可以在不使用荧光标记的情况下分析生物样品。荧光差分显微术基于的是 共聚焦显微成像技术，它是利用两个通过特定激发的光斑扫描得到的两张 图像之差来获得分辨率的提高的。即待分析的样品是分别被一个实心光斑 接着被一个空心光斑照明，将两者以不同的比重进行相减运算即可重构出 超分辨图像。实验结果显示，荧光差分显微在远场可以获取小于四分之波 长的分辨率并且具有较高的信噪比。

然而，这种荧光差分显微术存在图像变形以及信息丢失的问题。在之 前的系统中，空心光斑是通过采用一个0到2π的涡旋位相板调制一个与之 同向的圆偏光实现的。由于空心照明光斑的轮廓比实心光斑的要大得多， 两者相减后将导致获得的有效点扩散函数出现负值旁瓣，而某些正值的强 度可以通过负值强度来补偿，因此在图像重构的过程中，去除的负值强度 将导致信息的丢失。这个问题的关键解决方法便是找到某种方法使产生的 实心和空心光斑具有大致相等的尺寸。

发明内容

本发明提供了一种光子重组的非线性超分辨显微方法和装置，相对于 其他超分辨成像显微镜，该装置是基于共聚焦显微镜，其结构简单，成像 速度快，为生命科学和纳米技术提供了良好的研究手段。

本发明通过光子重组以消除图像变形而实现超分辨成像的方法，这种 方法被称为饱和光照明虚拟荧光差分超分辨显微术(svFED)。本显微术通 过高功率激光照明以达到荧光的非线性效应，采用针孔探测器阵列取代传 统共焦显微成像中放置于像面上的单个针孔探测器，利用光子重组技术， 结合类似于荧光差分显微术(FED)的方法，仅仅扫描所获取的空心光斑 而无需获取实心光斑，从而大大简化了实验装置并进一步提高了成像速 度；同时由于不存在负值旁瓣，使系统消除了成像变形这一困扰。仿真结 果显示光子重组的非线性超分辨率显微术相对于传统共聚焦显微术可提 高至少39％。

本发明的具体技术方案如下：

本发明提供了一种光子重组的非线性超分辨显微方法，针对荧光样品 包括以下步骤：

(1)激光器发出高功率照明光束，经第一透镜准直和扩束后得到准 直扩束光束；所述准直扩束后的照明光束经第一偏振片后，得到线偏振光；

(2)所述线偏振光经第一反射镜反射后进入0～2π涡旋位相板调制入 射光的相位；所述被调制位相后的线偏光经第一四分之一波片后补偿了后 面的二色镜和第二反射镜造成的位相差，使其在经第二反射镜反射后的出 射光为准确的线偏光；所述位相差得到补偿的偏振光经半波片后得到改变 了线偏振方向的出射光；所述出射光经二色镜反射后进入第二反射镜；所 述经第二反射镜反射的反射光再经过第二四分之一波片后变成位相受到 调制的圆偏振光；所述位相受到调制的圆偏光经过物镜后聚焦到位于所述 物镜焦面处样品平面上形成空心光斑照明荧光样品；

(3)所述荧光样品被高功率的空心光斑照明后，在非线性的作用下， 产生饱和效应，激发出饱和荧光；所述达到饱和效应的荧光被所述物镜收 集，经所述第二四分之一波片后由所述第二反射镜反射后进入所述二色 镜；所述荧光经所述二色镜透射后进入滤光片滤光后进入第二透镜；所述 经滤光片滤光后的荧光由第二透镜会聚到由多个光电探测器组成的探测 器阵列上参与成像；

(4)所述探测器阵列将光信号转换为电信号并传送给计算机；所述 计算机将每个探测器探测到的空心光斑做相应的平移后叠加，得到实心光 斑的图像，完成了对样品一个点的信息读入和处理；

(5)所述荧光样品放置于纳米移动平台上；所述样品平台与所述计 算机相连，通过所述计算机的控制软件实现纳米移动平台的在二维平面的 移动完成对所述荧光样品的二维扫描。

本发明还提供了一种光子重组的非线性超分辨显微装置，针对荧光样 品包括：

(1)高功率激光器，用于发出短波长高功率激光，实现对荧光样品 的照明，利用荧光的非线性效应，以使其达到饱和从而激发饱和荧光；