[发明专利]生产四氢叶酸的重组质粒、基因工程菌株构建及应用

权利要求书

1.一种重组质粒pMD-GTP，其特征在于，该重组质粒携带完整的包括序列表SEQID No.1所示的DNA片段的pMD19-T载体。

2.一种重组质粒pMD-DHNA，其特征在于，该重组质粒携带完整的包括序列表SEQID No.2所示的DNA片段的pMD19-T载体。

3.一种重组质粒pMD-HPPK，其特征在于，该重组质粒携带完整的包括序列表SEQID No.3所示的DNA片段的pMD19-T载体。

4.一种重组质粒pTrc99a-G，其特征在于，该重组质粒是通过将权利要求1中的重组质 粒pMD-GTP与大肠杆菌质粒pTrc99a分别用NcoI和KpnI双酶切，将切下的序列表SEQID No.1所示的DNA片段连接到质粒pTrc99a中得到的。

5.一种重组质粒pTrc99a-GD，其特征在于，该重组质粒是通过将权利要求2中的重组质 粒pMD-DHNA与权利要求4中的重组质粒pTrc99a-G分别用SmaI和BamHI双酶切，将切下的 序列表SEQIDNo.2所示的DNA片段连接到重组质粒pTrc99a-G中得到的。

6.一种重组质粒pTrc99a-GDH，其特征在于，该重组质粒是通过将权利要求3中的重组 质粒pMD-HPPK与权利要求5中重组质粒的pTrc99a-GD分别用PstI和HindIII双酶切，将切 下的序列表SEQIDNo.3所示的DNA片段连接到重组质粒pTrc99a-GD中得到的。

7.一株高产四氢叶酸基因工程菌，其特征在于：所述工程菌是通过将权利要求6的重组 质粒pTrc99a-GDH转入原始菌株大肠杆菌W3110中得到的。

8.权利要求1的重组质粒pMD-GTP的构建方法，其特征在于，所述方法包括：首先设计引 物：GTPup：-5′AGGCCATGGATGCCATCACTCAGTAAAGA3′-，划线处为NcoI酶切位点，GTP down：-5′AGGGGTACCTCAGTTGTGATGACGCACAG3-′，划线处为KpnI酶切位点；以大肠杆菌的 总DNA为模板，进行PCR扩增，得到一个669bp的片段，经测序证实其包含序列表中SEQID No.1的DNA片段，纯化PCR产物，连接到pMD19-T载体上，得到质粒pMD-GTP。

9.权利要求2的重组质粒pMD-DHNA的构建方法，其特征在于，所述方法包括：首先设计 引物：DHNAup：-5′AGGCCCGGGATGACTGCGACCTACACGAT3′-，划线处为SmaI酶切位点，DHNA down：-5′AGGGGATTCCTATTCGGCGACATGCTCGA3-′，划线处为BamHI酶切位点；以苜蓿中华根 瘤菌的总DNA为模板，进行PCR扩增，得到一个372bp的片段，经测序证实其包含序列表中SEQ IDNo.2的DNA片段，纯化PCR产物，连接到pMD19-T载体上，得到质粒pMD-DHNA。

10.权利要求3的重组质粒pMD-HPPK的构建方法，其特征在于，所述方法包括：首先设计 引物：HPPKup：-5′AGGCTGCAGATGGCGAGCGTGCTGATCGC3′-，划线处为PstI酶切位点，HPPK down：-5′AGGAAGCTTTTAACCGGTATCCGGAAGCC3-′，划线处为HindIII酶切位点；以大豆慢生 根瘤菌的总DNA为模板，进行PCR扩增，得到一个492bp的片段，经测序证实其包含序列表中 SEQIDNo.3的DNA片段，纯化PCR产物，连接到pMD19-T载体上，得到质粒pMD-HPPK。