[发明专利]一种产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法，属于生物化工技术领域，蛋白质工程。

二、背景技术

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，学名为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactoside，galactohydrolase，EC3.2.1.23)，商品名为乳糖酶(Lactase)，能够催化乳糖或乳糖类似物中β-1，4-半乳糖苷键的水解反应。

β-半乳糖苷酶广泛应用于食品工业、医学及生化分析等领域，尤其在乳品工业中起到极大的作用。常用于水解牛乳和其他乳制品中的乳糖，也可用来生成低聚半乳糖，广泛适用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产，将乳糖降解为葡萄糖和半乳糖以生产低乳糖奶，从而有效解决乳糖不耐症等问题。

β-半乳糖苷酶主要来源于动植物和微生物中。由于微生物具有生长速度快、代谢效率高及分离纯化相对简单等优势，微生物β-半乳糖苷酶成为工业化酶制剂的主要来源。但不同来源的乳糖酶酶学性质差异较大，如黑曲霉、米曲霉等来源的霉菌乳糖酶，催化温度较高(40～55℃)，但最适反应pH值较低(pH3.0～4.5)，适合奶酪加工副产物酸性乳清的处理；乳酸克鲁维酵母和脆壁克鲁维酵母等酵母来源的乳糖酶最适反应温度在中温附近(35～40℃)，而最适反应pH近中性(pH6.5～7.0)，适合牛奶加工中低乳糖奶(pH6.5～6.8)的生产：细菌乳糖酶比较复杂，最适反应温度从低温、中温到高温及超高温都有，但一般而言最适反应pH都在中性附近。

目前乳品工业用于分解乳糖的β-半乳糖苷酶多从酵母、曲霉菌或乳酸菌中经诱导产酶后提取获得。尽管目前诸多文献报道了筛选分离多种β-半乳糖苷酶菌株，如酵母菌、乳酸菌属、芽抱杆菌属、曲霉菌属等系列菌株的方案，但目前生产所用的β-半乳糖苷酶大多最适作用温度在30℃左右，在高温下的酶活力都很低，且成本高，难以满足市场及生产所需，且均存在热稳定性还不够好的缺点，严重限制了它在乳制品中的应用。如果采用耐高温β-半乳糖苷酶则将可克服热稳定性差的缺陷，酶在60℃及以上温度水解乳糖，可以有助于抑制杂菌微生物的生长。而且酶反应速度快，酶用量低，反应时间短，生产中可与巴氏杀菌同时进行或冷却阶段保温水解，即在巴斯德消毒过程中同时进行乳糖水解，将乳糖水解与巴氏消毒工序合二为一，不仅缩短生产周期，而且可以充分利用巴氏消毒的余热以降低能耗，从而显著节省生产成本。同时，针对其运输问题，也对它的耐热性提出要求。

我国据流行病调查研究表明，乳糖不耐症主要是有色人种比例较高，以亚洲人和美国黑人发生率最高。我国居民中约有75％～95％的人患有不同程度的乳糖不耐症。因此针对中国人，乳糖酶有着尤其重要的研究价值和意义。β-半乳糖苷酶还具有半乳糖苷转移作用，用于生产双歧因子，从而在益生菌食品生产中广泛应用。同时，在2015年1月，两岐双歧杆菌(Biofidobacteriumbifidum)被列为国家食品添加剂新品种。使得β-半乳糖苷酶将在食品加工行业具有更大的作用。

如何克服现有技术的不足，加快研发耐高温的β-半乳糖苷酶产品，已成为当今生物化工技术领域中函待解决的重点难题之一，具有十分重大的意义。类似的像公布号为CN103614313A，名为一种发酵产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法，以及公布号为CN102250856A，名为一种耐热β-半乳糖苷酶突变体的构建，分别提出发酵产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法和耐热β-半乳糖苷酶突变体的构建方法，都对研究如何产耐高温的β-半乳糖苷酶做出了一定贡献，但菌株是否高产和是否易于分离上没有明确的数据。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株及其筛选方法，该菌株产β-半乳糖苷酶的周期短、速度快、遗传稳定性好、热稳定性好、pH稳定性好、酶催化活力强，且培养条件简便、生产安全性高，耐高温。

根据本发明提出的一种耐高温β-半乳糖苷酶的菌株，其特征在于所述的菌株Z89的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现。根据本发明提出的一种产耐高温β-半乳糖苷酶的菌株的筛选方法，其特征在于依次包括如下步骤：

步骤一，样品采集：土壤样品采于温泉及牛奶场土壤；