[发明专利]一种酶法制备(R)-邻氯扁桃酸的方法及应用

权利要求书

1.一种酶法制备(R)-邻氯扁桃酸的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)通过基因工程的方法构建能表达腈水解酶的大肠杆菌菌种；

(2)将步骤(1)获得的能表达腈水解酶的大肠杆菌菌种通过发酵扩增培养，通过离心收集静息细胞；

(3)将收集的静息细胞、作为底物的5～40mmol/L的邻氯扁桃腈消旋体以及助溶剂加入pH＝7.0～9.0的缓冲液中，形成反应体系，在25～50℃的温度下反应将底物转化成(R)-邻氯扁桃酸；

(4)反应完后调节反应液至pH＝1～3，再用有机溶剂萃取出水相中的(R)-邻氯扁桃酸，分离出有机溶剂后得到(R)-邻氯扁桃酸的粗品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：

(5)再通过进一步纯化获得(R)-邻氯扁桃酸晶体。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)所述的腈水解酶是由以下基因表达：粪产碱杆菌来源的ZJUTB10、洋葱伯克菌属的ECU0401、LabrenziaAggregate来源的LaN、Agrobacteriumradiobacter来源的ArN2、Pseudomonassyringaepv.tomatostr.DC3000^a来源的PsN1、Variovoraxparadoxus来源的VpN。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述腈水解酶通过基因工程的方法与荧光蛋白融合。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白sfGFP、黄素荧光蛋白EcFb、红色荧光蛋白mCherry、冰核形成蛋白的荧光蛋白。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中构建能表达腈水解酶的大肠杆菌菌种的步骤采用无酶克隆方法。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的反应体系中，静息细胞的浓度为4g/L～60g/L。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的缓冲液为KH₂PO₄/K₂HPO₄缓冲液、NaH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液或者三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液；

优选地，所述步骤(3)的反应体系中，反应的pH为7.5～8.5；

优选地，所述步骤(3)中反应的温度为25～50℃；进一步优选地，所述步骤(3)中反应的温度为30℃；

优选地，所述步骤(3)中助溶剂为选自乙醇、甲醇、正己烷、正丙醇、异丙醇、正丁醇、乙腈、正己醇、正戊醇、正辛醇等有机溶剂中的一种或者几种；

优选地，所述步骤(3)中助溶剂添加的量为0.5％～10％(v/v)；进一步优选地，所述步骤(3)中助溶剂添加的量为1％～5％(v/v)。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)的反应完后用稀盐酸调节反应液至pH＝1～3；优选地，所述步骤(4)中分离出有机溶剂的方法为旋转蒸发。

10.腈水解酶在(R)-邻氯扁桃酸的制备中的用途，所述腈水解酶由以下基因中的一种表达：粪产碱杆菌来源的ZJUTB10，洋葱伯克菌属的ECU0401，LabrenziaAggregate来源的LaN，Agrobacteriumradiobacter来源的ArN2，Pseudomonassyringaepv.tomatostr.DC3000^a来源的PsN1，Variovoraxparadoxus来源的VpN。