[发明专利]一种以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法

说明书

技术领域

本发明属于软骨组织工程领域，尤其涉及一种以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法。

背景技术

目前，组织工程软骨材料被认为是最有应用前景的关节软骨修复材料。在软骨组织工程构建软骨的过程中，支架材料起到为细胞和生长因子提供支撑、粘附、分化、增殖及代谢场所的作用，可以把支架材料当作临时的细胞外基质。

目前并没有一种支架材料能完全满足软骨组织工程的要求，而仿生多相梯度设计已成为软骨组织工程支架设计的重要因素和必备要求之一。脱细胞基质材料因为能最大限度的继承细胞外基质成分，从而最能够充分遵循仿生设计原则。细胞外基质围绕在细胞周围，由细胞自身分泌的一系列组织，软骨支架材料通过模仿细胞外基质达到支撑细胞，为细胞和生长因子的粘附、分化、增殖、代谢及相关调控基因的表达提供场所。软骨支架材料研制的核心原则就是仿生设计，所以脱细胞软骨支架材料已成为当前软骨组织工程支架研究的热点。脱细胞软骨支架材料从来源上分类属于天然软骨支架材料的一种，具有生物组织相容性高、细胞黏附率高等优点；更重要的是，脱细胞材料降解率符合生物组织降解规律，降解产物易被机体所吸收，具备无炎症反应、毒性较小、抗原性低等优点；另外，脱细胞软骨支架材料在一定程度上仍然保留有胶原、糖胺多糖、层粘连蛋白及纤维粘连蛋白等多种天然细胞外基质成分，这些特点使得脱细胞软骨支架材料与其他类型软骨支架材料相比，能更加充分的仿生，并能更加有利于诱导细胞向其中黏附、增殖、分化及重建组织。但是，脱细胞软骨支架材料存在以下两大方面的缺陷：第一，脱细胞软骨支架材料与其它天然软骨支架材料一样，存在力学性能不佳、结构改性困难的缺点。而关节软骨在机体内的功能是承受重力或机体活动带来的力学负荷以及提供弹性润滑的接触面，这些都需要关节软骨必须具备出色的力学性能和微观结构。第二，脱细胞基质材料往往通过将同种异体或异种组织甚至器官经过脱细胞和去免疫原性等处理后获得。而关节软骨在机体内分布比例小，取材范围有限，加之取软骨操作难度大，很难将同种异体或异种关节软骨作为原材料大量成批的制备脱细胞软骨支架材料。

人工合成梯度材料因能够通过各种制备工艺控制和材料选择得到分梯度的支架材料，从而最大限度的模仿正常关节软骨的纤维走行，从而为使组织工程软骨复合体能最大限度的达到正常关节软骨的生物力学功能起到促进甚至决定作用，已经成为了当前研究的热点。但人工合成梯度材料的原材料均为人工合成，生物学性能较差，且往往不能很好的促进细胞的生物学行为的发挥，有碍软骨组织的生成和组织工程软骨组织复合体功能的发挥；并且，目前所研制的多相梯度软骨支架材料都存在过渡区域结合不牢的共同缺点，也就是说在两个不同相的接触面在抵抗剪应力时存在表现不佳的现象，而不同相接触面需要稳定的结合。找到使材料各层之间结合紧密的解决办法，或者找到一种天然过渡的连接紧密的一体化交界面也成为了当前研究的热点。

总而言之，目前尚未有理想的软骨组织工程支架材料。脱细胞支架材料虽然有着很好的应用前景，但脱细胞支架材料存在原材料来源有限以及力学性能不佳的缺点；多相梯度设计虽然被认为是目前理想软骨支架材料的必备设计要求，但多相梯度软骨支架材料几乎都为人工合成材料，生物学性能较差且无法很好的促进细胞生物学行为的发挥，并存在交界区域过渡不自然甚至不牢固的缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法，旨在解决天然脱细胞支架力学强度差、结构改性困难、原材料来源有限，以及多相梯度软骨支架材料生物学性能不佳的问题。

本发明是这样实现的，一种以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法包括：

步骤一、将新鲜人类脐带里的沃顿胶组织制作成梯度沃顿胶组织块，再经过消化冻融并冻干制作成一体化梯度脱细胞软骨支架材料。

步骤二、将检测合格的转化生长因子-β1缓释微球负载在支架材料上，与第3代脐带间充质干细胞进行复合诱导培养成组织工程梯度软骨复合体。

进一步，步骤一所述的制作分梯度的沃顿胶组织块的具体方法为：

将经过预冻的脐带标本垂直其长轴切成高20mm的圆柱体，剥离脐带外膜后完整切除中心脐血管区域，剩下呈环柱体形状的沃顿胶组织块，将环柱体沃顿胶组织块沿环柱体高度线切开，将沃顿胶拉伸展开成一大块长方体，最后选取较平整无缺损的部位将沃顿胶加工成12mm×8mm×3mm大小长方体的组织块。

进一步，步骤一所述的制作一体化梯度脱细胞软骨支架材料的具体方法为：

步骤一、将沃顿胶组织块置入含抗生素PBS液中浸泡冲洗5min，重复3次。