[发明专利]转录因子GATA3调控鸡肠道内糖转运蛋白SGLT1和GLUT5表达的方法

权利要求书

1.一种转录因子GATA3调控鸡肠道内糖转运蛋白SGLT1和GLUT5表达的方法，其特征在 于：首先对鸡小肠上皮细胞的体外分离培养及鉴定，获得培养细胞，然后利用生物信息学软 件寻找SGLT1和GLUT5基因5￠上游GATA3基因的结合位点，构建转录因子GATA3的真核表达载 体pcDNA3.1-GATA3，运用脂质体转染法将构建的真核表达载体pcDNA3.1-GATA3转染鸡小 肠上皮细胞，转染后收集鸡小肠上皮细胞并获得cDNA，最后利用实时荧光定量PCR检测cDNA 中目的基因GATA3、SGLT1和GLUT5的绝对表达量。

2.根据权利要求1所述的一种转录因子GATA3调控鸡肠道内糖转运蛋白SGLT1和GLUT5 表达的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

1).对鸡小肠上皮细胞的体外分离培养及鉴定：取15日龄的鸡胚，无菌操作取出小肠， 去除肠系膜分离小肠并清洗干净小肠组织块；采用嗜热菌蛋白酶HEPES消化液进行酶消化 组织块，使其形成细胞悬液，采用相差贴壁法培养鸡小肠上皮细胞，培养好鸡小肠上皮细胞 接种于细胞培养板，至于40℃7%CO₂培养箱内培养；将培养好的鸡小肠上皮细胞采用倒置 相差显微镜进行形态学鉴定，通过免疫组化进行细胞鉴定，获得培养细胞；

2).构建转录因子GATA3的真核表达载体pcDNA3.1-GATA3：

A.引物设计：NCBI中查找鸡转录因子GATA3的基因序列信息，按查到的基因序列应用 Primer3.0进行在线引物设计，所设计的引物为GATA3基因PCR克隆引物和GATA3基因荧光定 量PCR引物，引物信息见表1；

表1PCR引物

B.PCR扩增相应的基因片段：使用表1中引物对GATA3基因片段进行PCR扩增反应，

C.纯化回收的PCR产物进行连接转化，制备真核表达载体pcDNA3.1-GATA3：通过凝 胶电泳，对PCR产物的进行割胶回收，纯化得到的PCR产物连接转化至DH5α感受态细胞，菌体 扩大培养，培养好的菌液进行PCR测序鉴定，测序正确的菌液提取GATA3质粒，获得真核表达 载体pcDNA3.1-GATA3；

3).绝对荧光定量PCR反应体系的建立：测序正确的菌液提取GATA3质粒，用微量核酸和 蛋白测定仪测定质粒DNA的浓度和纯度，利用公式（1）计算出质粒拷贝数：

质粒拷贝数（copies/μL）=质粒浓度（g/μL）×6.02×10²³(/mol)/质粒的摩尔质量（g/ mol）公式(1)；查找到所得质粒的相对分子质量，稀释质粒，将稀释的质粒作为绝对荧光定 量PCR标准曲线的模板，进行绝对荧光定量PCR扩增反应，获得标准曲线和溶解曲线；

4).GATA3生物信息学分析：通过ModuleMaster、TFbind软件预测GATA3转录因子对两种 糖类转运蛋白基因GLUT5、SGLT1上游1500bp的调控区内的结合位点，然后采用脂质体转染 法将真核表达载体转染至鸡小肠上皮细胞；

5).转染后鸡小肠上皮细胞RNA的提取及RT-PCR检测：首先收集转染后的鸡小肠上皮细 胞，用37℃水浴30min预热好不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS缓冲液反复冲洗的收集好的转染后的 鸡小肠上皮细胞，然后提取细胞RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性和稳定性，然后将 RNA反转录合成cDNA；

6).荧光定量PCR检测GATA3、GLUT5及SGLT1的表达量：用绝对荧光定量PCR测定 pcDNA3.1-GATA3转染试验中空白对照组、阴性对照组细胞目的基因GATA3、GLUT5及SGLT1 的表达量；

7).数据统计分析：应用SPSS17.0统计软件中的Duncans方法对数据进行多重比较，分 析GATA3基因的过表达对GLUT5及SGLT1基因的表达的影响。

3.根据权利要求2述的一种转录因子GATA3调控鸡肠道内糖转运蛋白SGLT1和GLUT5表 达的方法，其特征在于：所述GLUT5和SGLT1荧光定量PCR的引物为表2；

表2：SGLT1和GLUT5荧光定量PCR的引物

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4.根据权利要求2述的一种转录因子GATA3调控鸡肠道内糖转运蛋白SGLT1和GLUT5表 达的方法，其特征在于：所述提取GATA3质粒是利用大提质粒盒提取得到GATA3质粒。