[发明专利]转基因植物中vip3A基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.转基因植物中vip3A基因的LAMP检测引物组，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、 内引物BIP，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物F3：AGGAGGACAACCTGGAGC（SEQIDNO：1）；

外引物B3：TCGTCCTTCAGGTGAATCGA（SEQIDNO：2）；

内引物FIP：GCACGTACAGGGCCTTGGTGAGGCCAACAACAAGAACGC（SEQIDNO：3）；

内引物BIP：TCAGCCAGTTCATCGGCGACCCTTCACGGTGTACTGGATC（SEQIDNO：4）。

2.转基因植物中vip3A基因的LAMP检测试剂盒，包括以下组分：

（1）检测引物溶液：由权利要求1所述的4条引物配制的检测引物溶液，外引物F3、外引 物B3、内引物FIP、内引物BIP的浓度依次为4~6μmol/L、4~6μmol/L、32~48μmol/L、32~48 μmol/L；

（2）具有链置换活性的BstDNA聚合酶：浓度为7~9U/μL；

（3）10×反应缓冲液：200mmol/LTris-HCl、pH8.8，100mmol/LKCl，100mmol/L (NH₄)₂SO₄，40~100mmol/LMgSO₄，6~14mol/L甜菜碱；

（4）dNTPs溶液，由浓度分别为10mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸 溶液等体积混合而成；

（5）显色剂：1000×SYBRGREENI荧光染料。

3.根据权利要求2所述的vip3A基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的检测引物 溶液中含有5μmol/L外引物F3、5μmol/L外引物B3、40μmol/L内引物FIP、40μmol/L内引 物BIP。

4.根据权利要求2所述的vip3A基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的BstDNA聚 合酶的浓度为8U/μL。

5.根据权利要求2所述的vip3A基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的10×反应 缓冲液中MgSO₄、甜菜碱的浓度分别为80mmol/L、8mol/L。

6.利用权利要求2~5任一项所述的试剂盒检测vip3A基因的方法，包括以下步骤：

（1）提取待测样品的基因组DNA；

（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：在200μL反应管内加入模板DNA2~5μL、检 测引物溶液1μL、BstDNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs溶液2~5μL，用灭菌 去离子水或超纯水补齐至总体积为25μL；

（3）在反应管盖上加1μL的显色剂，盖到反应管上；

（4）运行LAMP扩增反应：将反应管放置在恒温水浴锅中，65℃孵育60min，80℃孵育5min 终止反应；

（5）LAMP扩增结果的鉴定：颠倒反应管，使管盖上的显色剂与反应溶液充分混合，若反 应管显现绿色则为阳性，若显现橙色则为阴性。